Análisis Instrumental TEMA 10 Y 11. Maracaibo, febrero Profa. Cristina Uzcátegui Arrieta

Transcripción

1 Análisis Instrumental TEMA 10 Y 11 Maracaibo, febrero 2018 Profa. Cristina Uzcátegui Arrieta

2 QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA? Agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas

3 CROMATOGRAFÍA IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) Método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida.

4 CROMATOGRAFÍA Chroma = Color Graphein = escribir Mikhail Tswett, 1906 Separación de los pigmentos vegetales coloreados

5 CROMATOGRAFÍA Martin y Synge (1941) Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos en lana. Idearon la cromatografía de reparto. En 1952 recibieron el permio Nóbel en Química. iniciaron los estudios de cromatografía de reparto líquido-gas. En 1954, Giddings planteó la hipótesis que sería posible aplicar a la cromatografía de líquidos los mismo factores que hacían a la cromatografía de gases una poderosa técnica de separación. Fue el inicio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

6 EVOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA Desde la columna sencilla de Tswett, se ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy se conocen Cromatografo de gases con espectrofotómetro de masas Equipos para HPLC

7 En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil que se hace pasar a través de una fase estacionaria Eluyente COLUMNA Eluato Fase móvil Líquido o gas que transporta los analitos a través de una fase estacionaria. Fase estacionaria Sólido o líquido inmovilizado sobre el cual se reparte la especie de analito durante el paso de una fase móvil. Las interacciones química cruciales tienen lugar en la superficie de la fase estacionaria.

8 TÉRMINOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA Cromatografo Cromatograma Eluir Eluyente Detector Instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica. Representación gráfica de la composición de los solutos que salen de una columna cromatográfica en función del tiempo. Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. Disolvente aplicado al principio de una columna cromatográfica. Aparato que registra una propiedad físicoquímica del material eluido.

9 MÉTODOS INSTRUMENTALES Entrada de la fase móvil a b DETECTOR Cromatograma

10 Respuesta del detector REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA Tiempo de retención (t R ): Representa el tiempo transcurrido entre el instante de inyección y el determinado cuando el pico correspondiente en el cromatograma alcanza su máximo.

11 La separación de los componentes de la muestra problema se debe a la acción de dos efectos contrapuestos Efecto de retención Efecto de arrastre Ejercido sobre los componentes de la mezcla por la fase estacionaria que está situada en el soporte. Ejercido por la fase móvil que los empuja a través del camino recorrido.

12 Según el dispositivo utilizado para poner en contacto la fase estacionaria y la fase móvil TIPOS DE CROMATOGRAFÍA Según los estados de las fases implicadas Según el mecanismo de interacción del soluto con la fase estacionaria

13 CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFÍA FASE MÓVIL GAS LÍQUIDO FASE ESTACIONARIA Líquido Sólido Adsorbente Líquido Sólido Adsorbente Resina Gel SOPORTE Columna Columna Columna Plano Columna Reparto Adsorción Reparto Reparto Adsorción Intercambio iónico Tamaño molecular NOMBRE C.G.L c.gas-líq C.G.S c.gas-sól C.L.L c.líq-líq C.P c. papel C.C. F. c. capa fina C.L.S c. liq-sól C.C.I c. cambio iónico C.E.M c. exclusión molecular Figura tomada de Hernández, L. Introducción al análisis instrumental. 2002

14 Tipos de cromatografía Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil: Cromatografía en columna Cromatografía Plana

15 Tipos de cromatografía Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de presión.

16 Diluyente puro Representación esquemática de una separación cromatográfica Banda inicial con los solutos A y B A Empaquetado de la columna (fase estacionaria) suspendida en el disolvente (fase móvil) B Disco poroso Emerge B Emerge A Figura tomada de Harris, D. Análisis químico cuantitativo. 2007

17 CROMATOGRAFÍA PLANA Tipos de cromatografía Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil: La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.

18 Cromatografía en Capa Fina (TLC) CROMATOGRAFÍA PLANA Tipos de cromatografía Fase estacionaria Gel de sílice, celulosa, alúmina depositado sobre un soporte plano (lámina de aluminio o plástico) Fase móvil Ácido acético, agua, éter dietílico, metanol, benceno Cromatografía en Papel Fase estacionaria Hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua Fase móvil Agua, etanol.

19 Tipos de cromatografía Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil CROMATOGRAFÍA DE GASES Gas-líquido Gas-sólido CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Líquido-sólido, Líquido-líquido, Intercambio iónico, Exclusión molecular. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico.

20 Tipos de cromatografía MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Adsorción Afinidad Reparto Exclusión molecular Intercambio iónico

21 MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Cromatografía de adsorción El soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil. LO SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILAR Cromatografía de reparto Los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un proceso de extracción en continuo.

22 MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Cromatografía de intercambio iónico consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas.

23 MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Cromatografía de exclusión molecular Las moléculas de cierto tamaño presente en la fase móvil líquida o gaseosa son excluidas por la matriz que presenta poros de un determinado tamaño, impidiendo así su paso por el gel y, por tanto, acortando su tiempo de retención. Cromatografía de afinidad Se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Ejemplo: Anticuerpo-proteína.

24 Instrumentación Cromatográfica CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC) La cromatografía de gases incluye todos los sistemas cromatográficos en los que la fase móvil es un gas. La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte. La fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportarlo a través de la columna.

25 Instrumentación Cromatográfica CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC) HORNO

26 Instrumentación Cromatográfica Cromatografo de Gases

27 Instrumentación Cromatográfica CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida, o sólida disuelta, en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna cromatográfica.

28 Instrumentación Cromatográfica CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) High Performance Liquid Chromatography Bomba inyector Inyección Columna Desgasificador Eluente Horno para la columna Reservorio del solvente Desechos Detector

29 Instrumentación Cromatográfica Cromatografo HPLC

30 APLICACIONES Química Control de calidad Bioquímica Investigación

31 APLICACIONES Farmacia: antibiótico, sedantes, esteroides y analgésicos. Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos. Alimentos: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y aditivos. Compuestos industriales: aromáticos condensados, agentes tensoactivos, agentes propulsores, y colorantes. Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados. Química forense: drogas, venenos, alcohol en la sangre y narcóticos. Medicina Clínica:. Sales biliares, metabolitos de medicamentos, extractos de orina y estrógenos.

32 APLICACIONES Cromatografía Gas Líquido: análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de compuestos orgánicos Alimentos: para determinar especies volátiles, que en muchas ocasiones son responsables de olores y sabores característicos, para determinación de lípidos y ácidos grasos mediante procesos de derivatización. Análisis de drogas junto con HPLC Para la determinación de alquitranes, pinturas, películas fibras sintéticas mediante pirolisis. Para el seguimiento y el control de contaminantes en el medio ambiente (polutantes del agua, contaminación atmosférica)

33 La electroforesis se basa en la migración de iones presentes en una disolución por la acción de un campo eléctrico. Modificando convenientemente las condiciones de una electroforesis se pueden separar moléculas neutras e iones, así como isómeros ópticos, y disminuir los límites de detección.

34 Electroforesis Elektro: Electricidad Phoros: Movimiento Esta técnica fue introducida por el bioquímico sueco Arne Tiselius. Su interés principal fue la química de las proteínas séricas. Recibió el premio Nobel en el año 1948 por su gran contribución en el desarrollo de la técnica de electroforesis y por la importancia de su hallazgo sobre la naturaleza compleja de las proteínas del suero.

35 Método de separación de: Proteínas Ácidos nucleicos Otras biomoléculas Permite determinar: Peso molecular de una proteína Punto isoeléctrico Distinguir moléculas por su carga neta o su forma

36 Electroforesis Separación de especies cargadas, anión (-) y catión (+) Influencia de campo cargado eléctricamente Movimiento al cátodo (-) o al ánodo (+) Ánodo - + Cátodo Técnica de separación que consiste en el transporte de iones a través de una disolución por acción de un campo eléctrico.

37 FUNDAMENTO La electroforesis separa moléculas según su relación carga:masa Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa. Por ejemplo: si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo La movilidad electroforética (μ e ) depende de: La carga de la molécula, su tamaño y su forma. * la carga, a su vez, depende del ph de la disolución.

38 FUNDAMENTO LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN (V) DE LA PARTÍCULA es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio. V = q E / f

39 FUNDAMENTO El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales: inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma aleatoria o movimiento browniano

40 PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Parámetros externos - Campo eléctrico - Temperatura Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético - Viscosidad -Fuerza iónica -La naturaleza de los iones componentes -El ph Parámetros relacionados con el soluto - La carga - La forma y el tamaño de los iones

41 La velocidad de migración electroforética depende de los siguientes FACTORES: Carga: cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad, además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la dirección del desplazamiento. Tamaño y forma de las partículas: el tamaño del ión es un factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su movilidad. Fuerza iónica y ph del solvente: la mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.

42 FACTORES: Temperatura: el aumento de la temperatura puede traducirse en destrucción, o en la alteración de sus características (estructura, función, entre otros) de las que depende la movilidad electroforética. Viscosidad del medio: al disminuir la viscosidad aumenta la movilidad. Voltaje: no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor.

43 Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético DIFUSIÓN Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie. Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía cinética propia

44 Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético MIGRACIÓN: Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad. CONVENCIÓN: Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.

45 Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético FLUJO TÉRMICO Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema electroforético no es isotérmico. FRICCIÓN La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.

46 Métodos Electroforesis libre (en disolución) Electroforesis Zonal (sobre un medio soporte) En Papel Sílice Geles (a través de una matriz porosa) Agarosa Policramida

47 Electroforesis libre: sin la presencia de soporte Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una disolución. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución. Tiselius

48 Electroforesis zonal: presencia de soporte Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.

49 Medios de Soporte Soportes no restrictivos Porosidad del soporte mucho mayor que el tamaño de las moléculas. No ofrece restricción al avance de las moléculas. Se separan dependiendo de su densidad de carga. Soportes restrictivos Poros de tamaño similar al de las moléculas. Efecto de tamizado durante el avance. Se separan dependiendo de su tamaño. Ejemplo: acetato de celulosa (para proteínas), agarosa (para proteínas) Ejemplo: Agarosa (para ácidos nucleicos), poliacrilamida (para proteínas)

50 Medios de Soporte Papel Método sencillo y rápido Separación de: Proteínas Oligonucleótidos Carbohidratos Lípidos Desventajas Se desgarra fácilmente Distorsiona las bandas Se produce interacción entre las proteínas y los grupos hidroxilo de la celulosa

51 Electroforesis en Papel

52 Medios de Soporte Acetato de Celulosa Se usa en el análisis de fluidos biológicos (proteínas séricas, proteínas urinarias, hemoglobinas). Tiempo de análisis corto. Sencillez en la técnica. Desventaja: débil resolución Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilación, por lo que no hay interacción con las proteínas

53 Medios de Soporte Almidón Técnica económica, fácil y rápida. Gel Poliacrilamida Soporte más usado en electroforesis. Alta resolución. Componentes tóxicos Agarosa Buena resolución Separación de moléculas grandes (virus, ácidos nucleicos).

54 Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE) Polimerización de acrilamida Químicamente inertes Geles de porosidad controlable Forma geles transparentes Permiten buena visualización

55 Electroforesis en Gel de Agarosa Polisacárido obtenido de algas Separa moléculas grandes ( nucleótidos) Actúa en forma restrictiva frente a las fibras de ADN Presentan mucha carga negativa (migran hacia el ánodo)

56 Electroforesis en gel Isoelectroenfoque TIPOS DE ELECTROFORESIS Electroforesis capilar Electroforesis bidimensional

57 Cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte Sistema de revelado y lectura (Detector) Buffer COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO 2 electrodos Estándares y muestra Fuente de poder

58 COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO Cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte Buffer Estándares y muestra Fuente de poder 2 electrodos Sistema de revelado y lectura (Detector)

59 COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO

60 ESQUEMA DE EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR Capilares de sílica (75 μm x 60 cm) Temperatura constante (20 30º C) Detección UV Electrolitos Muestras y Estándares

61 Electroforesis capilar

62 VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR Alta resolución. Requiere pequeño volumen de muestra. Rápida separación. Automatización. Reproducibilidad. Puede acoplarse a otros equipos, como espectrometría de masa

63 MOLÉCULAS QUE PUEDEN SER SEPARADAS POR ELECTROFORESIS CAPILAR Proteínas. Péptidos. Amino ácidos. Ácidos nucleicos. Iones inorgánicos. Bases orgánicas. Ácidos orgánicos.

64 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS Es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo eléctrico. Método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.

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