De los orígenes a la actualidad

Transcripción

1 De los orígenes a la actualidad

2 Técnica Instrumental La herramienta analítica de mayor importancia

3 Componentes básicos C Fase móvil Control de flujo Introducción de muestra Horno Columna Detección Registro y proceso

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5 PROCESO CROMATOGRAFICO La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria. COLUMNA º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º º FASE MÓVIL FASE MÓVIL FASE MÓVIL COLUMNA

6 PROCESO CROMATOGRAFICO La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos. Los solutos se reparten entre ambas fases Fase estacionaria Muestra Fase móvil

7 PROCESO CROMATOGRAFICO AL ALIMENTAR LA MUESTRA AL SISTEMA, LOS SOLUTOS SE REPARTEN ENTRE LAS DOS FASES. Fase móvil Fase móvil t 0 t 0 Fase estacionaria Fase estacionaria

8 PROCESO CROMATOGRAFICO LAS MOLECULAS DE SOLUTO EN FASE ESTACIONARIA SE ESTANCAN LAS MOLECULAS EN FASE MOVIL AVANZAN CON ELLA Fase móvil Fase móvil t 1 t 1 Fase estacionaria Fase estacionaria

9 PROCESO CROMATOGRAFICO LA VELOCIDAD DEL SOLUTO VARIA INVERSAMENTE CON LA AFINIDAD POR LA FASE ESTACIONARIA. F. móvil F. estacionaria

10 SEPARACION DE SOLUTOS LOS COMPONENTES CON CONSTANTES DE REPARTO DIFERENTES SE SEPARARÁN. Fase móvil t 0 Fase estacionaria

11 SEPARACION DE SOLUTOS Fase móvil t 1 Fase estacionaria Fase móvil t 2 Fase estacionaria Fase móvil t 3 Fase estacionaria

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13 Dimensiones de la Columna L = Largo de columna (cm, mm) d c = diámetro interno (mm, µm) d f = espesor de película de fase (µm) d p = diámetro de partícula (µm) V o = volumen muerto (ml)

14 Velocidad y flujo de fase Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo, medido a la salida de la columna y a temperatura ambiente (ml/min) Velocidad de fase móvil = u = distancia media recorrida por la fase movil en una unidad de tiempo (cm/seg) 2 F = πr φ u

15 Tiempo Muerto (t 0 ) El tiempo que tarda en eluir un soluto que no interacciona con la fase estacionaria. El tiempo que se necesita para renovar totalmente la fase móvil de la columna. t o = V o / F o

16 TIEMPO DE RETENCIÓN t r = Tiempo transcurrido al momento de eluir el máximo de concentración del soluto. V r = volumen de retención = volumen de fase móvil gastado al momento de eluir el máximo de concentración del soluto. V r = t r F o

17 TIEMPO DE RETENCIÓN t r señal t o tiempo

18 Constante de Reparto Equilibrio de reparto: Soluto fm Soluto fe K = Soluto Soluto fe fm Cociente de las concentraciones del soluto. Soluto en la fase estacionaria entre soluto en fase móvil

19 Ecuación de la Retención V r = V o + KV e El volumen de retención de un soluto es la suma de las contribuciones del tiempo que estuvo en fase móvil (V m ) y en fase estacionaria (KV e ). K V r = V V e o

20 Tiempo de Retención Corregido t r t r señal t o tiempo

21 Factor de Capacidad Cociente de la cantidad de soluto en fase estacionaria entre la cantidad en fase móvil. k = n n soluto soluto fe fm

22 FACTOR DE CAPACIDAD t r t r señal tr k = = t o t r t o t o t o tiempo

23 Factor de Capacidad e k = K V = V o t r t o t o Medida de la retención del soluto. Indica que tan lejos del tiempo muerto eluye este.

24 Area y Altura del Pico Area Altura tiempo

25 Ancho del Pico señal w 0.5 ½ Altura Altura w b tiempo En mediciones manuales w 0.5 es mucho mas preciso que w b

26 PLATO TEORICO t r señal Definición más conocida: N = 16 tr w b 2 w 0.5 ½ Altura Altura tiempo w b

27 PLATO TEORICO t r Varias fórmulas: señal N 2 2 t t t = 16 = = 2π w w Area r r r b 0.5 Altura 2 w 0.5 ½ Altura Altura tiempo w b

28 Altura del Plato Teórico H = Altura equivalente a un plato teórico. H = L N L H

29 Eficiencia Cromatográfica H mide la eficiencia de la columna cromatográfica. Entre mas pequeño sea H, el sistema es más eficiente. ( mayor número de platos teóricos por metro. Para una misma longitud se logra mayor poder de separación con una menor H.

30 Separación de Solutos Señal tiempo

31 t r,1 t r,2 α = t r, t 2 r, 1 t o w b,1 w b,2

32 SELECTIVIDAD K2 k2 α = = K k = 1 1 t r, 2- t 0 t - t o La selectividad muestra las diferencias de afinidad por los solutos de las fases involucradas. Indica el potencial de separación de esos solutos en el sistema, pero no mide la separación real. r, 1 1

33 t r,2 t r,1 R s = 1 2 ( t t ) r, 2 r, 1 ( w + w ) b, 1 b, 2 w b,1 w b,2

34 RESOLUCIÓN R s = 0.8 R s = 1.0 R s = 1.5 R s = 2.0

35 RESOLUCIÓN Tres son los factores que influyen en la resolución cromatográfica: retención, selectividad y eficiencia: R s = k α 1 N 1 + k a 4 retención selectividad eficiencia

36 RESOLUCIÓN Solo controlando la retención la selectividad y la eficiencia se logra una buena separación.

37 RESOLUCIÓN Y RETENCIÓN 90% 75% R s k

38 RESOLUCIÓN Y SELECTIVIDAD R s Zona de trabajo usual α

39 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA 3.2 x R s 1.4 x x 0 20,000 40,000 60,000 80, N 1 2N 1 10 N 1 N

40 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA A mayor nímero de platos teóricos, mejor separación. La separación mejora apreciablemente solo si el aumento en N es de varios ordenes de magnitud. Los aumentos pequeños no son importantes, p. ej. duplicar el largo de columna duplica el tiempo de análisis y solo mejora en 40% la resolución. Las mejoras notables solo se logran mejorando las técnicas cromatográficas.

41 Tiempo total de análisis y resolución t t = 16 R 2 s α α 1 ANÁLISIS MAS RÁPIDOS SI: k ( ) k ( ) 2 H u R s pequeña, como se busca separar : 1.5 R s 2. α >> 1. k chica, para separar : 3 k 6. Se logran altas eficiencias (H pequeño) a velocidadesaltas de fase móvil.

42 Eficiencia Cromatográfica

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44 H = f (ensanchamiento de la banda) H = L N H = A+ B + C u u A = multicanales B= difusión C = resistencia a la transferencia de masa

45 Efecto Multicanales y/o Eddy A = 2λdp

46 Difusión axial B u = γ 2 Dm u Transferencia de masa en la FM movimiento

47 Ensanchamiento de la banda H e k ta u = k D 2 e Transferencia de masa en la FE

48 Transferencia de masa en fase móvil C m u = 2 Ωdu D p m

49 Transferencia de masa H sm = 1 θ + k ( ) 30 1 θ 1+ k 2 2 p 2 ( )( ) du yd M Transferencia de masa en la FM estancada

50 Ecuación de Van Deemter H 2 ( 1 θ ) ( θ )( ) 2γ Dm k t u Ωdu + k du = 2λdp u 1 + k D D k yd H = A+ B + C u u a p p 2 e m M

51 Efecto del diámetro de partícula

52 Digestión de enolasa. Efecto del tamaño de partícula en N y P

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56 Columnas Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de sílice fundida Dimensiones Longitud: 25 a 300 mm Diámetro: 25 µm a 100 mm Tamaño de partícula: 1.7 a 10 µm

57 Tipos de CL Cromatografía de intercambio iónico Adsorción: líquido-sólido Partición: líquido-líquido Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa Cromatografia de exclusión por tamaño

58 Empaques de UHPLC Images of current 1.9um particles

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61 Cromatografía de fase inversa FE FM Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C 18 octadecil, C 8 octil, C 4 tetrametil, C 2 dimetl Mezclas: agua/disolventes orgánicos H 2 O +(CH 3 OH, THF, CH 3 CN)

62 Cromatografía de fase inversa Efecto solvofóbico fuerte: Parte apolar de la molécula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H 2 O)

63 Fase móvil Disolventes grado cromatográfico Agua de 18 mω Baja viscosidad No vólatil Miscibilidad Filtrada Sin oxígeno disuelto (degasificada)

64 Fuerza del eluyente

65 Viscosidad del eluyente

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67 Análisis Isocrático Fase inversa, 10% CH3CN

68 Análisis Isocrático Fase inversa, 80% CH3CN

69 Análisis Isocrático Fase inversa, 50% CH3CN

70 Análisis por gradiente Gradiente exponencial de acetonitrilo

71 T t

72 Elución por gradiente

73 Detectores Indice de refracción Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroquímico Radioactividad Infrarrojo Espectrómetro de masas

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75 Proteínas por 2D nano UPLC

76 Cromatogramas de digestión de E. Coli

77 Fabricantes de Equipo HPLC Agilent Technologies Beckman Coulter Cecil Instruments Dionex Corp Hitachi PerkinElmer, Inc. Shimadzu Scientific Instruments Thermo Fisher Scientific Varian, Inc. Waters Corporation

78 Columnas para HPLC Agilent Technologies AkzoNobel Beckman Coulter Dionex Corp Merck KGaA Micro-Tech Phenomenex SGE Analytical Science Shimadzu Scientific Instruments Shodex Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Tosoh Corporation Varian, Inc. Waters Corporation W. R. Grace and Company (Vydac)