INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA Métodos fisicoquímicos en Biotecnología Trabajo de investigación CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA Presentan M. en C. Edgar Ernesto Esquivel Soto Q.F.B. Lidia Irene Leal Guadarrama

2 JUNIO 2004 CUERNAVACA, MORELOS 2

3 CONTENIDO INTRODUCCIÓN TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA La fase estacionaria Retención de modo mixto La fase móvil Elución por gradiente Parámetros cromatográficos Factor de capacidad Eficiencia Selectividad Resolución Cromatografía por supresión iónica Cromatografía secuencial Arreglo positivo negativo Arreglo negativo positivo Arreglo negativo negativo Arreglo positivo positivo APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA Purificación de biomoléculas Purificación de proteínas y péptidos naturales Purificación de péptidos y proteínas recombinantes Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas Purificación de péptidos sintéticos 3

4 Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamente Purificación a gran escala Desalado Análisis cuantitativo Normalización de área Calibración con estándar externo Calibración con estándar interno Adición de estándar 4

5 ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN ANÁLISIS DE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA Naturaleza química de la fase estacionaria Tamaño y forma de partícula Tamaño de la columna Velocidad de Flujo Temperatura Solventes Desnaturalización Gradiente de elución Acondicionamiento de columna Preparación de las muestras Limpieza de la columna Almacenamiento de columna Resolución de problemas EQUIPO DE HPLC Sistemas para el tratamiento de los disolventes Sistemas de bombeo Sistemas de inyección de la muestra Columnas Tipos de relleno de la columna Termostatos Detectores Detectores de absorbancia Detectores de arreglos de diodos Detectores de infrarrojo Detectores de índice de refracción Detector de dispersión de luz (ELSD) Detectores de espectrometría de masas PROVEEDORES COMENTARIOS 5

6 BIBLIOGRAFÍA INTRODUCCIÓN Los avances en el campo de la biotecnología han requerido el uso de técnicas más eficaces para la separación y purificación de biomoléculas. La cromatografía de líquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separación de mezclas complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de proteínas y ácidos nucleicos. En los inicios de la cromatografía de líquidos se utilizaban columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realizó sus trabajos el botánico ruso Mikhail Tswett. Él empleó esta técnica para separar varios pigmentos vegetales, que aparecían como bandas coloreadas en la columna. El relleno de las columnas consistía en partículas de 150 a 200 micras de diámetro. Más tarde se encontró que se podía aumentar la eficiencia disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. A finales de los años sesenta se logró desarrollar la tecnología adecuada para producir y utilizar partículas del orden de las 3 a 10 micras. A esta nueva forma de cromatografía se le llamó cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC por sus siglas en inglés (High Performance Liquid Chromatography). El sistema cromatográfico de fase reversa fue introducido por Howard y Marlin en Hasta ese momento, la cromatografía de líquidos se utilizaba básicamente para separar compuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carácter altamente polar y la fase móvil poco polar. Estos científicos revirtieron la polaridad de las fases con el objetivo de separar ácidos grasos. Así fue como surgió la cromatografía de fase reversa; aquella en la que la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. Entonces, a la primera modalidad de cromatografía se le empezó a conocer como cromatografía de fase normal. La técnica de fase reversa, RPC (del ingles Reverse Phase Chromatography), se ha convertido en el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC e incluye cerca de la mitad de los métodos de cromatografía de líquidos descritos en la literatura. Esta técnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un carácter predominantemente alifático o aromático. 6

7 En el presente trabajo se pretende dar al lector un panorama de la teoría y aplicaciones de la cromatografía en fase reversa, así como algunas consideraciones importantes durante el desarrollo de esta técnica cromatográfica. Y dado que la cromatografía de fase reversa se aplica en equipos de alta resolución (HPLC), también se incluye una sección en la que se describe brevemente su funcionamiento. TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA Todas las formas de cromatografía de líquidos son procesos de migración diferencial, donde los componentes de la muestra son selectivamente retenidos por una fase estacionaria y eluídos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase móvil. En la cromatografía de fase reversa (RPC) se utiliza un empaque hidrofóbico, usualmente un grupo funcional octadecilo u octilo y una fase móvil polar. La fase estacionaria La fase estacionaria para cromatografía de fase reversa consiste en una matriz porosa e insoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos. Los soportes para casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras. La superficie de la sílica está constituida por grupos silanol (SiOH) químicamente reactivos que abarcan una superficie cercana a los 8 μmol/m 2. (Figura 1) Si OH Si Si Si O CH 3 O Si (CH 2 ) 17 CH 3 CH 3 CH 3 Si O Si CH 2 CH 3 CH 3 7

8 Figura 1. Grupos silanol libres y grupos silanol derivatizados. La sílica presenta las ventajas de resistir la aplicación de altas presiones sin contraerse, y de no expandirse al contacto con los solventes. Pero tiene la desventaja de ser químicamente inestable; a un ph menor de 3 los ligandos unidos a la sílica pueden ser removidos y a un ph mayor de 7.5, la sílica se solubiliza. A diferencia de la sílica, las matrices de poliestireno son muy estables incluso en ph s que van desde 1 hasta 12, lo cual permite lavar y regenerar la columna con hidróxido de sodio que es el agente más efectivo para la remoción de proteínas fuertemente unidas a la superficie de la fase estacionaria. Además, el poliestireno tiene un carácter hidrofóbico per se (Figura 2) por lo que ya no requiere ser derivatizado, evitándose así el inconveniente de procesos ineficientes de unión de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja de expandirse al contacto con los solventes orgánicos típicamente empleados en RPC. CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH Figura 2. Estructura química de las matrices de poliestireno. El acoplamiento de los ligandos a la sílica generalmente se efectúa usando reactivos de tipo clorotrialquilsilanos. (Figura 3) En esta reacción, no todos los grupos silanol reaccionan ya que las cadenas alquilo generan un impedimento estérico que previene la derivatización completa de todos los grupos disponibles. El recubrimiento de la superficie por sililación se 8

9 limita a 4 μmoles/m 2. Los grupos silanol residuales imparten una polaridad indeseable a la superficie, y son responsables del efecto de retención de modo mixto. Para reducir este efecto, los grupos silanol residuales se hacen reaccionar con compuestos cloroalquilsilanos más pequeños como el clorotrimetil y clorotrietilsilano. A este proceso se le conoce como end capping o bloqueo. Si CH 3 OH + Cl Si (CH 2 ) 17 CH 3 CH 3 Si O Si (CH 2 ) 17 CH 3 + HCl CH 3 CH 3 Figura 3. Alquilación de grupos silanol. Por lo general, el grupo alquilo del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C 8 (noctilo) o una cadena C 18 (n octadecilo). (Figura 4) CH3 A) O Si CH2 CH3 CH3 CH3 B) O Si CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 C) O Si CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3 Figura 4. Ejemplos de grupos siloxanos. A) Grupo alquilo de 2 carbonos B) Grupo alquilo de 8 carbonos C) Grupo alquilo de 18 carbonos. 9

10 Puede considerarse que la RPC es un proceso de partición en donde los solutos están distribuidos entre una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los solutos no polares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema más lentamente que los solutos polares. El mecanismo que se ha propuesto para explicar el mecanismo por el cual estas superficies retienen a los solutos es el siguiente. Cuando un soluto se disuelve en agua, las fuerzas de atracción entre las moléculas de agua se distorsionan o se rompen. Únicamente los solutos altamente polares o iónicos pueden interaccionar con la estructura del agua. Los solutos no polares casi no interactúan con estas estructuras y como consecuencia abandonan la fase móvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la retención no es la interacción favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de repulsión del disolvente por el soluto. La fase móvil La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo un disolvente orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase móvil, la distribución de los solutos se cambia hacia la fase móvil. La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la concentración del ligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a ser adsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar sea la fase móvil, menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria. Respecto a las características químicas del ligando, es difícil predecir qué tipo de cadena hidrocarbonada será mejor para determinada aplicación. En principio, entre menos polar sea la molécula que se va a purificar, se requerirá una fase estacionaria más hidrofóbica. Sin embargo, si la muestra resulta ser muy afín a la matriz, la elución se dificultaría. Así que debe hacerse un análisis cuidadoso de la molécula de interés y determinar la naturaleza química de los contaminantes asociados. 10

11 La porosidad de las partículas de la fase estacionaria también es un factor importante que influye en la capacidad de unión. Los poros grandes facilitan la interacción del soluto con el ligando. Cuando se requiera una capacidad de unión máxima, deberá escogerse una matriz que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las moléculas de interés. Retención de modo mixto El modo mixto de retención resulta de la interacción de los grupos silanol cargados negativamente expuestos en la superficie de la matriz con los grupos cargados positivamente de las moléculas de la muestra. Genera ensanchamiento de picos e incremento de los tiempos de retención. Los grupos silanol expuestos en la superficie de la matriz pueden provenir de un endcapping ineficiente o del deterioro de las columnas. La superficie de la matriz se erosiona por el uso de la columna, lo que resulta en la exposición de los grupos silanol. El uso prolongado de soluciones acuosas también puede acelerar el envejecimiento de la columna. El uso de fases móviles de bajo ph, suprime la ionización de los grupos silanol, sin embargo, no hay que olvidar que un ph menor de 3 puede hidrolisar los ligandos de la matriz. El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa se basa en la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre del soluto mediante la fase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad como es el caso de una solución acuosa; a esta fase móvil inicial se le denomina fase A. Hay que tomar en cuenta que la polaridad de la fase móvil A debe ser suficientemente baja como para disolver al soluto de carácter hidrofóbico y suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a la matriz hidrofóbica. Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye la polaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de solventes orgánicos a la fase móvil A como son el metanol o el acetonitrilo. La fase móvil final, denominada fase B, es la que presenta menor polaridad y tiene el mayor poder de elución. La fuerza del solvente está definida cuantitativamente por el parámetro εº. (Tabla 1) Generalmente el ph de la fase móvil inicial y final permanece constante. El acetonitrilo y el metanol son los solventes más comunes puesto que ambos tienen baja viscosidad y no absorben luz UV. El isopropanol es un disolvente con alto poder de 11

12 elución, sin embargo, no es de los más empleados debido a su incrementada viscosidad que resulta en baja transferencia de masa del soluto entre las fases y elevación de presión aún en bajos flujos. Para describir cuantitativamente la polaridad de los disolventes, Synder desarrolló el índice de polaridad P. (Tabla 1) En esta escala, los valores de polaridad varían de 10.2 para un compuesto muy polar como el agua hasta 2 para los muy poco polares. Cualquier índice de polaridad que se desee entre esos límites se puede conseguir mezclando dos disolventes adecuados. De este modo, la polaridad P AB de una mezcla de disolventes A y B está dada por: P AB = Ф A P A +Ф B P B Donde Ф son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parámetros de polaridad de cada solvente. Índice de Viscosidad Índice de Fuerza Disolvente UV refracción cp polaridad P eluyente ε 0 nm a 25 C Ciclohexano ND Dietiléter **0.43 Tetrahidrofurano *3.7 Cloroformo **0.26 Etanol ND Metanol *1 Acetonitrilo *3.1 Isopropanol *8.3 Agua *Alta La fuerza del eluyente se estableció en base a una columna: *C18, ** silica. ND = No determinado Tabla 1. Índice de polaridad de Snyder. 12

13 Elución por gradiente Las separaciones isocráticas usan la misma composición de fase móvil a través de la separación. Las eluciones isocráticas se usan cuando la mezcla a separar no es muy compleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retención muy diferentes. Pero para separar mezclas de proteínas, generalmente se requiere de un gradiente de elución en el que la composición de la fase móvil cambia através del análisis como se indicó anteriormente. El gradiente de elución se recomienda generalmente para: Muestras que tengan tiempos de retención semejantes. Muestras de peso molecular mayor a Muestras de origen biológico. Aún cuando se piense utilizar una elución isocrática, es recomendable hacer un primer análisis por gradiente para determinar el porcentaje del solvente más adecuado. En cuanto a los tipos de gradiente, los hay lineales, curvos y escalonados o segmentados. (Figura 5) Lineal Curvo Segmentado %B %B %B Tiempo Tiempo Tiempo Figura 5. Formas de los gradientes más comunes 13

14 Parámetros cromatográficos El comportamiento de retención de un compuesto refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente termodinámico de repartición. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. K= C E C M Donde C E y C M son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y la fase móvil respectivamente. Factor de capacidad La razón de reparto o razón de capacidad, k, relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna, es decir, es la relación del tiempo transcurrido en la fase estacionaria contra el tiempo transcurrido en la fase móvil. Matemáticamente se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil: C E V E k '= C M V M El factor de capacidad puede ser calculado para cada pico usando la siguiente ecuación: t R t 0 k '= t 0 Donde t R es el tiempo de retención de la muestra y t 0 es el tiempo de retención de un soluto que no interactúa con la fase estacionaria, también conocido como tiempo muerto. El 14

15 tiempo de retención transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el compuesto alcanza el detector. El primer componente eluído deberá tener un tiempo de retención del doble del tiempo muerto. Dicho de otra manera, la razón de reparto es el tiempo adicional que un soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido, para el cual k =0. La fase móvil seleccionada debe dar valores de k que estén en el rango de 1 a 20. Valores mayores de k generan tiempos de retención largos que resultan en tiempo analítico desperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resolución adecuada entre los solutos. Los solventes fuertes proveen pequeños valores de k, mientras que los solventes débiles dan valores de k más altos. Se ha visto que por cada 2 unidades de diferencia en el valor de polaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k cambia un orden de magnitud aproximadamente, lo que significa que la retención del compuesto en una columna particular puede variarse simplemente mediante la modificación de los solventes de la fase móvil Eficiencia Una característica importante de un sistema cromatográfico es su eficiencia, expresada como una cantidad adimensional llamada número de platos teóricos. El término plato teórico proviene de un estudio teórico en el que se trató a una columna como si estuviera constituida de numerosas, discretas y contiguas capas denominadas platos teóricos. Refleja el número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de la columna. Entre más grande sea el número de platos teóricos de una columna, mayor será su eficiencia y por tanto se podrá lograr una mayor resolución. La eficiencia de una columna puede determinarse a partir de un pico del cromatograma mediante la siguiente ecuación: 15

16 N = t R W 1/2 Donde t R es el tiempo de retención del pico y W 1/2 es ancho del pico medido a la mitad de la altura del mismo. (Figura 6) Absorbancia t R W 1/2 Alto de pico Tiempo Figura 6. Determinación de la eficiencia de una columna en base a un pico de un cromatograma. El número de platos teóricos algunas veces es reportado como platos por metro de columna. En esta expresión, la altura equivalente a un plato teórico H está dada por la ecuación: H= L N Donde L es longitud de columna y N es el número de platos teóricos. La eficiencia depende principalmente de las propiedades físicas de la matriz y de la columna. La eficiencia mejora mucho al disminuir el diámetro de la columna, al aumentar su longitud y al reducir el tamaño de partícula del empaque o al bajar la viscosidad del disolvente. 16

17 Selectividad La selectividad se refiere a la capacidad del método para distinguir las propiedades de los componentes a nivel molecular y que permite diferenciarlos. Es importante determinar las características de la molécula que nos permitirán separarla, ya sea peso molecular, carácter ácido base, polaridad, tamaño, actividad bioquímica, óptica, etc. La selectividad puede ser física o química, dependiendo de la naturaleza de las interacciones entre el grupo funcional y el medio de separación. Las interacciones que involucran fuerzas de dispersión, dipolos y fuerzas de hidrógeno se consideran físicas. Por otro lado, un equilibrio ácido base o la formación de complejos se clasifican como selectividades químicas. La selectividad física es la que predomina en RPC porque en este método los componentes son separados de acuerdo a sus polaridades. Esto significa que la RPC puede usarse para separar grupos de compuestos de acuerdo a su estructura química. Las pequeñas diferencias en las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias de adsorción y por lo tanto permite su separación por RPC. La selectividad (α) es equivalente a la retención relativa de los picos de la muestra y está dada por la siguiente expresión: ' k 2 α= ' k 1 V 2 = V 1 Donde V 1 y V 2 son los volúmenes de retención, k 1 y k 2 son los factores de capacidad para los picos 1 y 2 respectivamente. Resolución La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos solutos. Los parámetros que contribuyen en la resolución (Rs) de los picos son la selectividad (α), la eficiencia o número de platos teóricos (N) y el factor de retención k. (Figura 7 y 8) 17

18 Estos parámetros se relacionan en una ecuación de la siguiente manera: Rs= α 1 4 α N k ' 1 k ' V 2 V 1 R s = V 2 V 2 W 2 + W 1/ 2 W 1 W 2 Figura 7. Determinación de la resolución en un par de picos de un cromatograma. 18

19 A B A B 95 % A 95 % B 99 % A 99 % B R s = 1 R s = 1. 5 Figura 8. Resolución de picos en diferentes cromatogramas. En el segundo cromatograma hay mayor resolución porque los picos están más separados uno de otro. Para mejorar la resolución de una columna se pueden variar cada uno de los siguientes parámetros: Factor de capacidad: es el elemento más manipulable debido a que depende de la polaridad de la fase móvil. Para una resolución óptima, k debe estar en el intervalo entre 2 y 5. Número de platos teóricos: los números de platos teóricos se incrementan aumentando la longitud de la columna. Sin embargo, una consecuencia adversa es un incremento del tiempo necesario para la separación. La relación entre N y Rs está definida por el cuadrado de N. Por ejemplo, un incremento en el número de platos teóricos N de 100 a 625 aumentará la resolución por un factor de 2.5 y no por uno de Otra forma de mejorar la resolución consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede conseguirse disminuyendo el tamaño de partícula del relleno o bajando la viscosidad del disolvente. Selectividad: implica modificar las características químicas del relleno de la columna. 19

20 Cromatografía por supresión iónica La cromatografía de pares iónicos o cromatografía por supresión iónica es un tipo de cromatografía de fase reversa que se utiliza para la separación de especies ionizables. Se recomienda el uso de este tipo de cromatografía especialmente para moléculas cargadas de gran peso molecular como las proteínas o los ácidos nucleicos. En este modo de cromatografía, se añade a la fase móvil un compuesto iónico que aporta un contra ión orgánico grande; la concentración de estos agentes está en un rango de 0.01 % a 0.03 %. El mecanismo exacto de la cromatografía de pares iónicos no se ha establecido claramente, sin embargo, existen dos modelos fundamentales. El primero postula que la molécula del soluto forma un par iónico con el contra ión en la fase móvil y de esta manera aumenta la hidrofobicidad de la muestra. (Figura 9) El grado en el que la muestra ionizada y el contra ión forman el complejo de par iónico, así como la fuerza de unión del complejo con la fase estacionaria, afecta al tiempo de retención de la muestra. Al aumentar la concentración del contra ión, aumenta la retención hasta un límite que generalmente está dado por la solubilidad del contra ión en la fase móvil. El otro mecanismo postula que el contra ión se retiene en la fase estacionaria que es normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puede entonces formar complejos con los iones orgánicos de carga opuesta. Es muy probable que el mecanismo real involucre a ambos postulados. Luego, la elución de los pares iónicos se consigue mediante una fase móvil que contenga metanol u otro disolvente orgánico miscible en agua. 20

21 Péptidos cargados positivamente Agentes supresores d e iones cargad os negativamente Oligonu cleótid os cargad os negativam ente Agentes supresores d e iones cargados positivamente + Figura 9. Supresión de cargas de proteínas y de ácidos nucleicos. El agente más usado para la supresión de cargas en proteínas es el ácido trifluoroacético y para los ácidos nucleicos es la trietilamina. El control del ph es el parámetro más importante en este tipo de cromatografía. La retención aumenta conforme el ph maximiza la concentración de la forma iónica de los solutos. Un ph bajo asegura que las bases fuertes estén en su forma iónica protonada y que los ácidos débiles presentes estén en su forma no iónica. La fase móvil es preparada generalmente con ácido trifluoroacético (TFA) o el ácido ortofosfórico que mantienen el ph cercano a 3. El mayor beneficio de los ph s bajos usados en la cromatografía de supresión iónica es la eliminación del efecto de modo mixto que genera un incremento en el tiempo de retención y un ensanchamiento de picos. Pero al mismo tiempo, el método de supresión iónica está limitado a un intervalo de ph de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fases estacionarias fuera de este intervalo de ph. 21

22 Cromatografía secuencial En este tipo de cromatografía las columnas se acoplan de manera secuencial, es decir, se conecta una columna después de otra. De esta manera los compuestos a analizar interactúan de manera independiente con cada soporte y los mecanismos de retención son diferentes en cada columna. La consideración más importante en el diseño de acoplamiento de columnas involucra la compatibilidad de la fase móvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la unión selectiva de los compuestos de interés en una o ambas columnas. Las columnas pueden acoplarse de manera que los contaminantes queden retenidos en la primera o en la segunda columna. Esta modalidad es empleada más frecuentemente para la purificación de proteínas. A continuación se revisan los tipos de acoplamiento. Arreglo positivo negativo En un acoplamiento de columnas positivo negativo, la proteína de interés se une a la primera columna y los contaminantes fluyen sin interactuar. En la segunda columna los contaminantes quedan retenidos, pero la proteína de interés no. En los siguientes pasos se cambia la polaridad de la fase móvil generando la elución de la proteína de una manera concentrada. Generalmente las proteínas están presentes en muy bajas concentraciones en las muestras biológicas, así que la estrategia más eficiente es utilizar una columna que retenga a la proteína y la concentre. Arreglo negativo positivo La columna inicial retiene a los contaminantes, mientras que la segunda columna une a la proteína de interés. En este arreglo, la primera columna (llamada negativa porque no 22

23 retiene a la proteína o componente de interés) generalmente se remueve, luego se procede la elución de la proteína de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantes interfieran puesto que fueron eliminados al retirar la primera columna. Una de las desventajas de este arreglo es que la primera columna debe unir a la mayoría de los compuestos contaminantes. Arreglo negativo negativo La proteína de interés no tiene ningún tipo de interacción con ninguna columna. La desventaja de este arreglo es que la proteína se va diluyendo conforme atraviesa el sistema cromatográfico. Arreglo positivo positivo Es el arreglo que genera la mayor selectividad pues la proteína es retenida tanto en la primera columna como en la segunda, así que de alguna manera la proteína se somete a dos pasos de purificación. La proteína se une a la columna inicial y los contaminantes pasan de largo. Cuando la proteína eluye de la primera columna pasa a la segunda donde es retenida. En este caso se requiere de un segundo proceso de elución para liberar a la proteína. 23

24 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA La cromatografía de fase reversa fue desarrollada en 1950 y fue ideada para la separación de pequeñas moléculas orgánicas. Más tarde, con la aparición de nuevos soportes para la fase estacionaria y nuevos detectores, se convirtió en una herramienta indispensable para la separación de biomoléculas como proteínas, péptidos y oligonucleótidos. Purificación de biomoléculas En la actualidad, la RPC se usa de manera generalizada para separar los siguientes grupos de biomoléculas: Proteínas y péptidos de origen natural Proteínas y péptidos recombinantes Péptidos obtenidos por digestión enzimática Péptidos sintetizados químicamente Oligonucleótidos sintéticos A continuación se señalan algunas consideraciones generales para lograr estrategias de purificación correctas. Purificación de proteínas y péptidos de origen natural La purificación de péptidos y proteínas a partir de sus fuentes naturales requiere de diferentes técnicas cromatográficas debido a la complejidad de la mezcla original. Para el último paso de purificación se usa la RPC y la filtración por gel de alto rendimiento. Sin embargo, la RPC no es un método tan apropiado para separar péptidos y proteínas de fuentes biológicas debido a la presencia de lípidos y otros solutos altamente hidrofóbicos que se unen fuertemente a la fase estacionaria, dificultando su separación de la columna. Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar moléculas provenientes de mezclas biológicas complejas. En primer lugar, si una proteína o péptido se va a utilizar en estudios funcionales, debemos asegurarnos que la actividad biológica se 24

25 mantiene después de cada paso de purificación. Este no es un problema crítico cuando se trata de péptidos o proteínas pequeñas, pero las proteínas grandes tienden a desnaturalizarse bajo las condiciones de la RPC. La elección adecuada del medio de fase reversa y las condiciones de elución, incluyendo el tiempo de exposición a condiciones potencialmente desnaturalizantes, deberá optimizarse a fin de mantener la integridad funcional de la molécula. Además, la presencia de proteasas en las muestras puede dificultar la purificación de polipéptidos, por lo que es aconsejable trabajar con agilidad durante las primeras etapas de purificación a fin de minimizar el tiempo de contacto entre las proteasas y la muestra. Una manera de evitar la degradación de proteínas es adicionando a la solución amortiguadora inhibidores específicos de proteasas. Otro problema común de purificación a partir de mezclas naturales es el fenómeno de agregación. Los agregados solubles como dímeros o trímeros pueden ser separados de los monómeros por filtración en gel. Purificación de péptidos y proteínas recombinantes La dificultad para aislar péptidos o proteínas de sus fuentes naturales, se puede superar a través de la producción de éstas con técnicas recombinantes. Los polipéptidos intracelulares son más difíciles de purificar, ya que es necesario lisar las células para su obtención. En cambio, las proteínas o péptidos secretados al medio son relativamente fáciles de purificar y en general, no son susceptibles a las proteasas intracelulares. La purificación de péptidos recombinantes del medio extracelular puede dificultarse por los volúmenes tan grandes que se obtienen por lo que se requiere de un paso inicial para concentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al péptido una secuencia terminal específica como proteína A, glutatión trasferasa, o poli amino ácidos, lo que permitirá una purificación cromatográfica por afinidad. Una vez concentrado y purificado el péptido será necesario remover el asa a través de métodos enzimáticos o químicos. La purificación de péptidos recombinantes puede monitorearse mediante RPC, análisis de amino ácidos, mapeo de epítopes, bioensayos o electroforesis en gel de poliacrilamida. Purificación de péptidos obtenidos por digestiones enzimáticas 25

26 La digestión de una proteína con proteasas, usualmente tripsina, genera una mezcla de péptidos que pueden ser separados por RPC para obtener un mapa peptídico de la proteína. Incluso puede asignarse la posición de los puentes de disulfuro al comparar los cromatogramas de una digestión en donde los puentes de disulfuro permanezcan intactos y los cromatogramas de otra digestión en donde los puentes de disulfuro hayan sido reducidos con β mercaptoetanol. Purificación de péptidos sintéticos En la actualidad, la síntesis química de péptidos menores de 20 amino ácidos es un procedimiento de rutina en muchos laboratorios. Las cantidades sintetizadas van de miligramos hasta gramos. La generación de péptidos sintéticos genera contaminantes adyacentes como péptidos truncados o con modificaciones en la secuencia de aminoácidos. También se encuentran presentes pequeñas moléculas orgánicas como fenol y tioles, producidos al separar el péptido sintético de la fase estacionaria o soporte. Los péptidos con menos de 20 aminoácidos, en general, se pueden obtener con un alto grado de pureza usando solamente RPC. Para purificar microgramos de muestra podría utilizarse un empaque con partículas de 5 μm, pero si se requieren cantidades mayores será necesario utilizar una matriz de 15 a 30 μm. Purificación de oligonucleótidos sintetizados químicamente La síntesis de fase sólida automatizada es un procedimiento comúnmente utilizado para generar oligonucleótidos de 20 a 30 pares de bases de largo. El carácter hidrofóbico de las bases nitrogenadas disminuye en el orden adenina>timina>guanina>citosina. Entonces, los oligonucleótidos ricos en adenina tenderán a eluir más lento que aquellos ricos en citosina. Los principales contaminantes son secuencias truncadas junto con pequeñas cantidades de oligonucleótidos que difieren en la secuencia. La separación entre las secuencias completas de las incompletas se puede simplificar si la purificación se lleva a cabo usando grupos protectores 5 tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera sólo los oligonucleótidos completos tendrán la hidrofobicidad suficiente para permanecer anclados a la fase estacionaria. 26

27 Purificación a gran escala La purificación a gran escala de péptidos y oligonucleótidos sintéticos o proteínas recombinantes por cromatografía de fase reversa requiere de una alta resolución para la separación de estos compuestos. En estos casos, la purificación a escala analítica se optimiza usando una matriz de fase reversa de partículas pequeñas y se escala utilizando una matriz con una selectividad similar pero hecho con partículas más grandes. Hay esencialmente tres etapas en la purificación de una biomolécula a partir de extractos o muestras naturales: la captura, purificación intermedia y el pulido. El propósito de la captura es aislar, concentrar y estabilizar la molécula blanco de la muestra cruda en forma rápida y con un buen porcentaje de recuperación. La captura no se espera que sea un paso altamente resolutivo, pero es necesaria para aislar la molécula de interés de distintas sustancias contaminantes; es decir, es un proceso de separación de grupo. La fase intermedia de purificación se enfoca en separar a la molécula blanco de la mayoría de las impurezas como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. La capacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa de purificación dado que los contaminantes presentes comparten características funcionales y estructurales con la molécula blanco. El pulido es el último paso para la obtención de un producto puro, este procedimiento se utiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que el producto final pueda ser obtenido puro para su posterior uso. Los contaminantes en esta etapa son a menudo muy similares a la molécula blanco. Los más comunes incluyen a variantes estructurales y conformacionales de la propia molécula. Desalado La desalación es un procedimiento de rutina en el laboratorio y consiste en la separación de contaminantes de bajo peso molecular de las biomoléculas de mayor peso molecular. A este procedimiento en ocasiones también se le denomina cambio de buffer. Las técnicas no cromatográficas para desalar incluyen a la ultra filtración y a la diálisis. 27

28 Las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos pueden desalarse adecuadamente usando la cromatografía de fase reversa puesto que las muestras pueden recuperarse y reconstituirse en volúmenes pequeños y de esta manera evitar el fenómeno de dilución que resulta de la filtración por gel. Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volúmenes pequeños de fase móvil de baja polaridad, típicamente acetonitrilo. Si el solvente utilizado es volátil, éste puede ser removido por evaporación y la muestra residual podrá ser resuspendida en el volumen deseado de otro solvente o solución. Análisis cuantitativo La cromatografía de fase reversa también puede proporcionar información cuantitativa acerca de las especies separadas, lo cual le da un impacto de aplicación aún mayor a esta técnica. La cuantificación en RPC se basa en la comparación del área del pico del compuesto problema con las de uno o más estándares. Los instrumentos cromatográficos están equipados con integradores electrónicos digitales, los cuales permiten una precisa estimación de las áreas de pico. Hay cuatro técnicas principales para la cuantificación: normalización de área, calibración con estándar externo, estándar interno y la adición de estándar. Normalización de área El área de los picos se reporta como un porcentaje de área total. (Figura 10) Ésta técnica es muy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; la desventaja es que asume que todos los componentes tienen el mismo nivel absorción a la longitud de onda que se monitorea. 28

29 93% 2.8% 2.2% 0.8% 1.2% Tiempo Figura 10. Ejemplo de normalización de área. Calibración con estándar externo Implica preparar soluciones del estándar con una concentración conocida. Se inyecta el mismo volumen de cada solución y se construye una curva de calibración en función de la concentración y las áreas de pico. La concentración de los estándares debe ser parecida a la concentración que se espera para las muestras. Las muestras de concentración desconocida se preparan, inyectan y analizan de la misma manera. La concentración de las muestras se obtiene a partir de la curva de calibración. A este método se le llama estándar externo porque los estándares se analizan en cromatogramas separados de las muestras. Calibración con estándar interno Consiste en la adición de un compuesto diferente al analito a cada una de la soluciones que se van a analizar. Se analizan soluciones de muestra de diferentes concentraciones a las que se ha añadido la misma cantidad de estándar interno. 29

30 Requerimientos para un estándar interno: Tener buena resolución (Rs>1.25) Factor de capacidad similar al compuesto problema El compuesto que se utilice como estándar interno no debe estar presente en la muestra original Que tenga alto grado de pureza Adición de estándar Este método se usa para análisis de trazas. Diferentes cantidades del analito que se desea medir se adicionan a la solución problema, la cual contiene una concentración desconocida de analito. A la cuantificación total se le resta el valor de la cantidad adicionada; de esta manera se puede calcular la concentración desconocida. 30

31 ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN ANÁLISIS DE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA En la siguiente sección se tratarán algunas consideraciones que hay que tomar en cuenta en la aplicación de la cromatografía de fase reversa para la separación de biomoléculas como es la selección de columna, la fase móvil, las condiciones de elución, preparación de las muestras, manejo de las columnas, así como la resolución de problemas más comunes. Naturaleza química de la fase estacionaria Para la separación de proteínas grandes hay una preferencia a usar sílicas con ligandos n butilo y n octilo sobre los alquilos n octadecilo ya que las biomoléculas no son capaces de intercalarse en las capas n alquilo largas como lo hacen las moléculas pequeñas; además, no se genera una adsorción tan fuerte de las proteínas en las cadenas alquilo pequeñas y por consiguiente se requiere menor cantidad de solventes orgánicos para la elución, lo cual disminuye el riesgo de desnaturalización de la proteína. Tamaño y forma de partícula La accesibilidad de la muestra a la matriz depende en gran medida del tamaño de poro. Los empaques con tamaños de poro menores de 300 armstrongs se usan para la separación de péptidos y oligonucleótidos. Generalmente se recomiendan tamaños de poro de 300 armstrongs o mayores para la separación de proteínas porque como se mencionó anteriormente, los poros grandes generan mejor resolución para biomoléculas más largas. El tamaño de la partícula también difiere entre una separación analítica y una preparativa. Las separaciones analíticas se desarrollan en columnas con partículas de 3 a 5 micras, las preparativas con partículas de 10 a 30 micras y las separaciones a gran escala utilizan partículas de 40 a 50 micras. El inconveniente es que a mayor tamaño de partícula, la columna se vuelve más frágil y por tanto se reduce su tiempo de vida. 31

32 Respecto a la forma de las partículas, las columnas con empaque de partículas irregulares son menos caras que las partículas esféricas y son más comúnmente empleadas en aplicaciones de gran escala. Tamaño de la columna La resolución de biomoléculas de alto peso molecular en las separaciones de fase reversa, es menos sensible al largo de la columna que la resolución de moléculas orgánicas pequeñas, de tal manera que los ácidos nucleicos, proteínas y péptidos largos pueden ser purificados eficientemente en columnas cortas. El incrementar el largo de las columnas en general no incrementa la resolución significativamente y sí podría dañar a las proteínas porque la pérdida de actividad biológica es proporcional al tiempo de residencia de la proteína en la columna. Por otra parte, las separaciones analíticas generalmente usan columnas de 100 a 250 mm de largo x 4 mm de diámetro; y las separaciones preparativas requieren columnas con diámetros más anchos, por ejempo, de 9 mm aproximadamente. Velocidad de Flujo La velocidad de flujo es un factor importante para la resolución de moléculas pequeñas, ya que la tendencia de las moléculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo, produciendo picos más angostos y por lo tanto, mejora la resolución. Las proteínas tienen menor difusibilidad que las moléculas pequeñas, por lo que se obtiene una buena eficiencia aún con flujos bajos. Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm de diámetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que se desarrollan en columnas de 250 mm x 9.4 mm de diámetro utilizan flujos de 4 ml/min. Las variaciones en la velocidad de flujo son especialmente significativas en las separaciones a gran escala, pero no es crítica en los experimentos analíticos. Temperatura La temperatura puede afectar profundamente a la cromatografía de fase reversa, especialmente la utilizada para solutos de bajo peso molecular, péptidos pequeños y 32

33 oligonucleótidos. Dado que el transporte de masas en solución entre la fase móvil y la fase estacionaria es un proceso controlado por difusión, incrementar la temperatura disminuye la viscosidad del solvente y esto generalmente favorece la transferencia de masas y por lo tanto, mejora la resolución. En cambio, cuando las proteínas se desnaturalizan por un incremento de la temperatura, la estructura de éstas se desdobla y tiene más sitios de interacción con la fase estacionaria, por lo tanto se incrementa el tiempo de retención. Solventes Todos los solventes, soluciones amortiguadoras, sales, así como el agua usada para preparar la fase móvil, deben ser de alta pureza química, libre de iones metálicos así como de partículas suspendidas. La pureza química es importante en RPC preparativa puesto que cualquier contaminante en la fase móvil puede producir picos indeseables, y contaminar la biomolécula purificada. Los solventes usados para preparar la fase móvil o la fase móvil ya preparada deben desgasificarse en un baño de ultrasonido por 10 a 15 minutos para prevenir la formación de gas que afectaría la estabilidad de la columna. También pueden desgasificarse utilizando vacío y burbujeando helio. Desnaturalización Las interacciones de las proteínas con los solventes orgánicos, en general, conduce a cierta pérdida de la estructura terciaria que puede generar varios estados conformacionales y cada estado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. El desdoblamiento puede exponer los residuos hidrofóbicos de la proteína con el consecuente incremento de la retención, lo que puede generar insuficiente recuperación de la proteína. Los complejos enzimáticos y proteínas de componentes múltiples son más lábiles a perder actividad que los péptidos pequeños. Ahora bien, el proceso de desnaturalización presenta una cinética lenta y puede reducirse este proceso disminuyendo el tiempo que la proteína permanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalización, la conformación podría regenerarse al reincorporar la proteína a sus condiciones nativas. En caso de que una proteína o péptido fuera purificada con el fin de determinar su estructura primaria, la desnaturalización no sería un problema. 33

34 Gradiente de elución La retención de las proteínas disminuye exponencialmente al adicionar a la fase móvil un modificador orgánico. Este comportamiento de las proteínas obliga al uso de eluciones con gradiente para la separación de mezclas proteicas. Cuando se pretende separar por primera vez los componentes de una mezcla compleja, se usa un gradiente grueso para una separación inicial, que servirá para ajustar la forma del gradiente hasta llegar al punto óptimo. Esto usualmente implica la disminución de la pendiente del gradiente en el lugar donde eluyen los componentes deseados y del aumento de la pendiente antes y después de ese punto. La elección de la pendiente del gradiente dependerá de que tan próximos eluyan los componentes contaminantes de la molécula blanco. Por lo general, cuando disminuimos la pendiente del gradiente incrementamos la resolución, pero también aumentamos los tiempos de retención. Los gradientes en RPC siempre provienen de una condición de alta polaridad (fase móvil A altamente acuosa) a una de baja polaridad (fase móvil B con alto contenido de solvente orgánico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como el incremento en el porcentaje de la fase móvil B por unidad de tiempo (%B/min) o por unidad de volumen (%B/ml). Un gradiente típico va de 0 % B a 100 % B en 10 a 30 volúmenes de columna. Con un flujo de 1 ml/min para una columna de 1 ml, corresponde un gradiente de 3 a 10 % B/min. Acondicionamiento de columna El acondicionamiento de columna debe realizarse siempre que se use una columna por primera vez, después de un almacenamiento prolongado, y cada vez que se desee cambiar la fase móvil para un análisis. El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase móvil que la del análisis cromatográfico. El procedimiento general para el acondicionamiento de las columnas es el siguiente: 1. Lavar con 3 volúmenes de columna de fase móvil B para eliminar posibles contaminantes del análisis anterior. 34

35 2. Correr 2 a 3 volúmenes de columna de un gradiente lineal de 100 % fase B a 100 % fase A. No debe cambiarse de manera abrupta la fase móvil porque existe el riesgo de que la columna se dañe. 3. Equilibrar con fase A hasta que todas las señales de monitoreo sean estables. Cada vez que se cambie la fase móvil, es importante correr un blanco para corroborar la ausencia de impurezas y analizar la estabilidad del sistema. Después de haber equilibrado la columna con la fase móvil A, el segundo paso es aplicar la muestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase móvil A. La molécula de interés deberá unirse a la matriz y los solutos indeseados serán arrastrados por la fase móvil. Preparación de las muestras La muestra debe disolverse en la fase móvil que se empleará para hacer el análisis cromatográfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase móvil, puede adicionarse ácido fórmico, acético o alguna sal; este procedimiento mejora la solubilidad y no afecta la separación, siempre y cuando estos agentes se encuentren en bajo porcentaje. Todas las muestras deben centrifugarse a 10,000 rpm por 10 minutos antes de la inyección o filtrarse a través de una membrana de 0.22 micras para eliminar partículas. No se recomienda almacenar las fases móviles acuosas de ph neutro por más de 3 días porque existe el riesgo de crecimiento microbiano y además la muestra podría oxidarse. Limpieza de la columna Se recomienda limpiar la columna periódicamente, especialmente cuando se detecte una elevación en la presión o pérdida de resolución. Hay que considerar que la pérdida de resolución debido al ensanchamiento de los picos puede deberse a la presencia de grupos silanol en la superficie de la sílica o incluso a la disolución de la matriz debido al uso frecuente de fases móviles con ph por arriba de 7. Un procedimiento común de limpieza es: 35

36 1. Lavar a bajo flujo con varios volúmenes de columna utilizando 0.1 % de TFA (ácido trifluoroacético) en agua. 2. Correr un gradiente, aproximadamente 20 a 30 volúmenes de columna, desde 0.1 % de TFA en agua hasta 0.1 % de TFA en isopropanol. El isopropanol es muy usado para la limpieza de columnas debido a su alto poder de elución. 3. Equilibrar con 100 % de isopropanol conteniendo 0.1 % de TFA y luego llevar la columna nuevamente a agua con 0.1 % de TFA empleando un gradiente. 4. Utilizar un gradiente para introducir la fase móvil A. 5. Equilibrar con varios volúmenes de columna de fase móvil A antes de iniciar el análisis. Para columnas de poliestireno, un procedimiento efectivo de limpieza es equilibrar con varios volúmenes de columna empleando hidróxido de sodio 0.5 M. El hidróxido de sodio es un agente de limpieza muy efectivo. Almacenamiento de la columna Las columnas de fase reversa hechas a base de sílica no deben almacenarse en soluciones acuosas debido a la inestabilidad de la sílica en condiciones acuosas. Las columnas deben almacenarse en solventes orgánicos como metanol libre de TFA. Resolución de problemas A continuación se presentan algunas soluciones para los problemas más comunes durante el desarrollo de un análisis por cromatografía de fase reversa. Síntoma Causa Solución 36

37 El flujo de la columna se ha reducido. Presencia de material particulado en la fase móvil. Filtre las muestras y la fase móvil antes de usarlas. Precipitación de proteínas en la columna. Reemplace el filtro de la fase móvil, la precolumna, y/o la columna. En ambos casos limpie y regenere la columna. No hay flujo por la columna. La presión se incrementa durante una o varias corridas. La bomba no funciona. Alguna pieza, adaptador o tubo del sistema esta obstruído. Precipitación de la muestra en la columna. Revise que la bomba esté funcionando adecuadamente. Verifique si la bomba o el sistema presentan fugas o si hay obstrucciones. Limpie y regenere la columna. Reemplace el filtro de la fase móvil, la precolumna, y/o la columna. Cambie el aditivo usado para solubilizar la muestra. Filtre las muestras y la fase móvil antes de usarlas. Síntoma Causa Solución La muestra no eluye en el gradiente usado. La concentración del solvente B en el gradiente es muy baja. El poder de elución del solvente orgánico es muy bajo. Incremente la concentración del solvente. Sustituya la columna por una con ligandos menos hidrofóbicos. Cambie el solvente por otro de mayores propiedades de elución. 37

38 Los componentes de la muestra eluyen en la fase de equilibrio. La resolución es menor a lo esperado. La muestra no es lo suficientemente hidrofóbica para adsorberse en la columna. La concentración inicial de solvente es muy alta. La pendiente del gradiente es muy alta. Baja selectividad El volumen de la celda de detección es muy grande. La columna esta mal empacada. Proteínas o lípidos precipitados en la columna. Incremente la concentración del agente supresor de iones. Cambie la columna por una con ligandos más hidrofóbicos. Sustituya el solvente orgánico por otro con menores propiedades de elución. Disminuya la concentración del solvente. Use un gradiente más bajo. Adicione o ajuste la concentración del agente supresor de iones. Cambie la celda de flujo. Determine los platos teóricos de la columna y de ser necesario, cámbiela Limpie y regenere la columna. Incremente la concentración de solvente en la fase móvil inicial. Síntoma La resolución es menor a lo esperado. La concentración de la muestra es demasiado alta. Causa Hay grupos silanol libres en la superficie de la fase estacionaria. La velocidad del flujo es muy alta. Limpie y regenere la columna. Disminuya el volumen de carga de la muestra. Solución Disminuya el ph para suprimir la ionización de los grupos silanol o cambie de columna. Disminuya el flujo de elución. 38

39 Ensanchamiento de banda o asimetría. No se puede reproducir un perfil de elución previo. Buena recuperación de la muestra pero poca actividad biológica. La columna está mal empacada. La columna está sobre cargada. Hay difusión de la muestra. La columna no está equilibrada, falta acondicionamiento. La fase móvil no se preparó correctamente o el solvente se evaporó. Alteración de la muestra durante el almacenaje. Los componentes de la muestra están desnaturali zados o inactivados en la fase móvil. Determinar el número de platos teóricos. De ser necesario reemplace la columna. Limpie y regenere la columna. Disminuya el volumen de carga de la muestra. No debe haber más de 1 mg de muestra por gramo de fase estacionaria. Incremente la velocidad de flujo. Continúe el acondicionamiento de columna hasta que la línea basal sea estable, aproximadamente 5 a 10 volúmenes de columna. Prepare nuevamente la fase móvil. Prepare nuevamente la muestra. Disminuya el tiempo de corrida a fin de limitar la exposición de la muestra a los reactivos de la fase móvil. Use una matriz con ligandos menos hidrofóbicos para disminuir la concentración de solvente B en la fase móvil o cambie el solvente de la fase móvil. Síntoma Causa Solución 39

40 La cantidad de muestra en las fracciones eluídas es mucho menor a lo esperado. Precipitación de la muestra. La muestra se ha adsorbido fuertemente a la columna por retención iónica. La muestra se ha degradado por proteasas o nucleasas. Cambie la composición de la fase móvil a fin de mantener la estabilidad. Disminuya el ph de la fase móvil o adicione un agente supresor de iones. Agregue inhibidores de proteasas o nucleasas o minimice el tiempo de separación. Picos muy pequeños Picos extraños en el cromatograma. Ruido en el cromatograma La muestra absorbe poco a esa longitud de onda. Impurezas en la fase móvil. Elución incompleta de la corrida anterior. Burbujas de aire atrapadas en la columna o en la celda del detector. Monitoree la muestra a diferente longitud de onda. Use reactivos de mejor calidad. Lave la columna. Elimine el gas de la fase móvil. El tiempo de retención para un mismo componente de la muestra aumenta con el tiempo. Hay un comportamiento de modo mixto debido a grupos silanol en la superficie de la sílica. Disminuya el ph para suprimir la ionización de los grupos silanol. O bien, cambie la columna. 40

41 EQUIPO DE HPLC La técnica de fase reversa es el tipo de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC que son las siglas del inglés High Performance Liquid Chromatography. La cromatografía de líquidos de alta resolución utiliza presiones elevadas para hacer pasar un flujo de fase móvil a través de una columna empacada con partículas micrométricas. Sin la aplicación de presión sería prácticamente imposible que el eluyente pasara a través de la columna. Dadas las características de una columna de cromatografía de fase reversa, se requerirá de un equipo de HPLC para realizar la separación. Así que es relevante comentar de forma general cómo está conformado este equipo. Un equipo de HPLC básicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse el flujo de la fase móvil a través de la columna, una columna que separe los componentes de la muestra, un detector que mida alguna característica de dichos componentes conforme van saliendo de la columna y un procesador que convierta la señal electrónica del detector en un cromatograma. La figura 11 muestra un esquema de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico; enseguida se explicará brevemente cada uno de los componentes. Fuent e de helio regulada Válvula d e s alid a Am o r t ig uad o r d e puls ac io ne s Válvula d e d r e naj e Bomba Válvula d e e nt r ad a Ent rada de j eringa para cebar Al det ect or Co lum na Transduct or de presión Válvula d e iny e c c ió n Filt r o Re g ulad o r d e c o nt r a pr e s ió n 41

42 Figura 11. Diagrama que muestra las partes más importantes que integran un cromatógrafo de líquidos de alta resolución. Sistemas para el tratamiento de los disolventes Los recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos, como oxígeno y nitrógeno, que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC modernos cuentan con recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relación de los disolventes en forma programada y modificar los valores de manera lineal o exponencial. Sistemas de bombeo Las bombas utilizadas en el HPLC son muy potentes y precisas. El flujo debe ser libre de pulsaciones y con un caudal que pueda variar entre 0.1 y 10 ml/min, la presión puede ser hasta de 6000 psi (lbs/in 2 ) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosión. Existen tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa y bombas de presión constante o neumática. La bombas recíprocas son las más usadas, el 90 % de los equipos de HPLC modernos cuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de una cámara por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones que se manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma. Entre las ventajas de estas bombas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 μ l), sus altas presiones de salida (por encima de las 10,000 psi), su fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente. Como una parte más del sistema de bombeo esta el restrictor colocado a la 42

43 salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido, se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. Sistemas de inyección de la muestra A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos por HPLC, es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobre carga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de 20 μl hasta 500 μl. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza dispositivos en forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones de hasta 7000 psi con una precisión aceptable. Columnas Como se explicó en la primera parte de este trabajo, la separación de los componentes de la muestra se produce en la columna. La mayoría de las columnas para HPLC se construyen con tubos de acero inoxidable de diámetro interno uniforme. Esta clase de tubos miden entre 10 y 30 cm. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 μm. Para aumentar la vida de la columna analítica se coloca delante una pre columna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición del relleno de la pre columna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de la partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión. 43

44 Tipos de relleno de la columna El relleno puede ser de dos tipos de partículas porosas o pediculares. El último consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 μm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada de sílice. El relleno pedicular se utiliza ampliamente en pre columnas y no para columnas analíticas. Los rellenos de partículas porosas para HPLC están formados por micro partículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. La sílice es el material más comúnmente empleado para este tipo de columnas, debido a que se pueden producir partículas con diámetros muy uniformes. Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de las columnas se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los aparatos lleva hornos que controlan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisión la temperatura es colocando las columnas en camisas con agua que provenga de un baño de temperatura constante. Detectores Los detectores en cromatografía de líquidos como HPLC son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la fase móvil que responden a cambios en el índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, las cuales se modifican por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades de la muestra como es la absorción en UV, fluorescencia, actividad óptica, etc. Algunos de estos detectores se describen a continuación. Detectores de absorbancia 44

45 Son los detectores más empleados ya que tanto las proteínas como los ácidos nucleicos absorben luz de esta región. Las longitudes de onda típicamente monitoreadas son: nm: corresponde a la absorción de la unión peptídica. Se usa principalmente para monitorear péptidos que carecen de aminoácidos aromáticos. 228 nm para His 240 nm para Cys 254 nm para Phe nm para medir oligonucleótidos 280 nm para Trp y Tyr Los detectores de absorbancia ultravioleta más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. La desventaja que presentan estos aparatos es que el efluente no se puede monitorear a varias longitudes de onda al mismo tiempo. A fin de reducir el ensanchamiento de banda, el volumen de una cubeta de flujo (en forma de Z) para medir absorbancia ha de ser lo menor posible. Las longitudes de la cubeta van de 2 a 10 mm (Figura 12) de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10 μ l. Además la presión no debe ser mayor de unos 600 psi. pues existe el riesgo de romper la cubeta del detector. De la columna Vent anas de cuarzo Fuent e UV Det ect or Al desecho Figura 12. Esquema de la cubeta de un detector de absorbancia. Detectores de arreglos de diodos 45

46 Este tipo de instrumentos permiten hacer barridos a distintas longitudes de onda de cada uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una colección de cromatogramas a diferentes longitudes de onda de cada pico. Mediante los arreglos de diodos se puede determinar la mejor longitud de onda a la que debe monitorearse el compuesto de interés. Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros y espectrofluorímetros. La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Una ventaja de los detectores de florescencia es su alta sensibilidad, unas tres órdenes de magnitud mayor a la obtenida por métodos de absorbancia. Detectores de infrarrojo Una de las mayores limitaciones del uso de detectores de infrarrojo se debe a la interferencia generada por los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones. Detectores de índice de refracción Son considerados detectores universales, pues el índice de refracción es una propiedad física de todos los compuestos. Miden las variaciones en el índice de refracción de la fase móvil cuando hay diferentes solutos presentes. Estos detectores tienen la desventaja de no ser tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector de absorbancia. Además son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que se requiere un estricto control de ésta. Detector de dispersión de luz (ELSD) El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una nube mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las gotitas viajan a través de un tubo de conducción 46

47 a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas del compuesto problema. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que puede emplearse para casi todos los solutos no volátiles y es más sensible que el detector de índice de refracción. Detectores de espectrometría de masas La espectrometría de masas es el método de detección más reciente y cada vez se generaliza más su uso. La muestra al salir de la columna es ionizada. Luego los iones se separan de acuerdo a su relación carga/masa. 47

48 PROVEEDORES A continuación se presentan los nombres y direcciones electrónicas de los proveedores más importantes de columnas y equipos cromatográficos. Compañía ABI Alltech Beckman Bio Rad Merck J & W Scientific J.T. Baker Perkin Elmer VWR Waters Whatman Página de internet Otras páginas de internet de interés eng/biotech Environ/IONEX/be_index.htm home 0 0,00.html Phase Chromatography.html 48

49 COMENTARIOS Sin duda, la cromatografía de fase reversa se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigación biotecnológica. Esta técnica de separación debe su crecimiento a su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo y versatilidad. Justamente la adaptabilidad de la cromatografía de fase reversa permitió el surgimiento de la cromatografía por supresión iónica y la secuencial que se revisaron en el presente trabajo. También se procuró dar una visión de las aplicaciones de la cromatografía en fase reversa en el área de la biotecnología y algunos aspectos a considerar al momento de desarrollar una separación de fase reversa. Con seguridad se seguirán implementando modificaciones de la técnica que permitan expandir aún más su uso. Ahora la tendencia es el empleo de columnas capilares que mejoren la resolución de los análisis así como el acoplamiento a detectores más sensibles que generen mayor información del compuesto en estudio como los arreglos de diodos y los espectrómetros de masas. BIBLIOGRAFÍA 1. Karger B.L., Snyder L.R. and Horvath C., An introduction to separation science. John Wiley and Sons, Canada, Gooding K. and Regnier F., HPLC of Biological Macromolecules, Vol 51, Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., USA, Hearn M., HPLC of proteins, peptides and polynucleotydes, VCH Publishers Inc., USA, Howard G.A. and Martin A.J.P., The separation of the C 12 C 18 fatty acids by reversedphase partition chromatography, Biochem J, 1950, 46: Lindsay S. High Performance Liquid Chromatography, 2 nd ed., John Wiley and Sons, UK, Reversed Phase Chromatography. Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Sweden, Skoog D. A. and Leary J. J., Análisis instrumental, 4a ed., McGraw Hill, México,

50 8. Snyder L. R., Kirkland J. J. and Glajch J. L., Practical HPLC method development, 2 nd ed., John Wiley and Sons, USA,