cromatografía 03/07/2012 Tipos de cromatografía en columnas Curso: Química Analítica II Loreto Ascar 2012 LIQUIDO SUPERCRITICO
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- Sandra Palma Ayala
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1 cromatografía Curso: Química Analítica II Loreto Ascar 2012 GASES FLUIDO SUPERCRITICO LIQUIDO CROMATOGRAFIA GAS - SOLIDO CROMATOGRAFIA GAS - LIQUIDO COLUMNA PLANAR LSC BPC IEC SEC TLC PC BPC - RP BPC - NP GPC GFC Tipos de cromatografía en columnas LSC : Cromatografía sólido-líquido o de adsorción BPC : Cromatografía de fase enlazada IEC : Cromatografía de intercambio iónico SEC : Cromatografía de exclusión por tamaños BPC-RP : Cromatografía de reparto de fase inversa BPC-NP : Cromatografía de reparto de fase normal GPC : Cromatografía de permeación en gel GFC : Cromatografía de filtración en gel 1
2 CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA De acuerdo al tipo de contacto existente entre las 2 fases involucradas Superficie Plana Columna En papel (PC) Capa Fina (TLC) Electrocromatografía (EC) De gases Líquida Fluidos supercríticos Cromatografía en papel Técnica de mediana resolución en el cual una mezcla de solutos sembrada sobre un papel de filtro logra separarse entre si basándose en: Los diferentes coeficientes de partición de los solutos entre la fase estacionaria (fibra de celulosa del papel) y la fase líquida orgánica móvil, subiendo a través del papel por capilaridad. Diferenciasen la adsorción del soluto a las fibras de celulosa y disolución en la fase móvil. Cromatografía en Capa fina (TLC) Soporte del adsorbente, láminas de: Vidrio Plástico(ej: acetato) Metal(ej: aluminio) Fases Estacionarias: Gel de Sílica(Se utiliza en el 80% de las separaciones) Alúmina (Óxido de Aluminio) Celulosa (Nativa o microcristalina) Poliamidas 2
3 Cromatografía en Capa fina (TLC) Fase Móvil Polar Apolar Ácidos Carboxílicos Alcoholes Aminas Tioles Aldehidos Cetonas Esteres Éteres Hidrocarburos no saturados Hidrocarburos Saturados Cromatografía en Capa fina (TLC) Fase Móvil Éter de petróleo Tolueno Dietil-éter, t-butil-éter Diclorometano Acetato de etilo n-pentano, n-hexano Ciclohexano Tetracloruro de carbono Cloroformo Acetona Iso-propanol Etanol Metanol Ácido acético El índice de retención Rf (Ratio of Front): Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente 3
4 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Muestras: líquidas (no volátiles) sólidas disueltas en un solvente adecuado termolábiles Fase móvil: líquido Fase Estacionaria Origen: columnas de vidrio Diámetro: 1 a 5 cm Longitudes: 50 a 500 cm Diámetro partículas: 150 a 200 µm Tiempos de análisis largos (varias horas) Altura de plato teórico (H) d p : Diámetro de las partículas de relleno, cm λ : Factor de empaque Rellenos de 3 a 10 um HPLC Tipos de cromatografía líquida de alta resolución Cromatografía de reparto Cromatografía de adsorción o líquido-sólido Cromatografía iónica Cromatografía de exclusión por tamaños o de geles Permite la determinación de: Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, cabohidratos, fármacos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y especies inorgánicas 4
5 Instrumentación para HPLC Instrumentación para HPLC 5
6 Recipientes para la fase móvil Filtrar la fase móvil Desgasificar Un solo disolvente o una mezcla Desgasificación de la fase móvil Bombeo de vacío Destilación Reflujo Agitación Purga con gas inerte (He) Desgasificador en línea Características de la Fase móvil Componentes de la muestra deben ser solubles en ella No degradar ni disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad Compatible con el detector 6
7 Tipos de elución Isocrática Composición de la fase móvil constante en el tiempo En Gradiente Composición de fase móvil variable en el tiempo 7
8 Elución Isocrática A: Tampón acuoso (KH2PO4 25mM a ph 3,5) B: Acetonitrilo (1) Alcohol bencílico (2) Fenol (3) 3,4 -dimetoxiacetofenona (4) Benzoína (5) Benzoato de etilo (6) Tolueno (7) 2,6 dimetoxitolueno (8) o-metoxibifenilo Elución en Gradiente (1) Alcohol bencílico (2) Fenol (3) 3,4 -dimetoxiacetofenona (4) Benzoína (5) Benzoato de etilo (6) Tolueno (7) 2,6 dimetoxitolueno (8) o-metoxibifenilo Sistemas de Bombeo La bomba debe proporcionar un flujo continuo y reproducible en el tiempo Debe ser capaz de entregar presiones de trabajo altas, debido al pequeño tamaño de las partículas de relleno Libre de pulsaciones Intervalodecaudal 0,1a10mL/min Componentes resistentes a la corrosión 8
9 De desplazamiento Neumáticas Recíprocas Tipos de bombas Bombas Recíprocas Sistema de inyección de muestra Precisión en la medición de la muestra, es un factor limitante en HPLC Se debe introducir la muestra como un tampón No se debe despresurizar el sistema 9
10 Válvulas Inyectoras, válvulas de loop o bucles Columnas y Fases Estacionarias La columna consiste en un segmento de tubo de algún material inerte, de diámetro uniforme y capaz de resistir altas presiones. Existen de vidrio de paredes resistentes y de acero inoxidable (mas utilizado) Existen de diferentes tamaños y rellenos Existen columnas analíticas y preparativas Columnas para HPLC Diámetro interno: 4 a 10 mm Longitudes: 10 a 30 cm Diámetro partículas: 5 a 10 µm a platos/metro Actualmente se están elaborando columnas mas pequeñas, de hasta 7,5cm de largo y con rellenos menores a 2 µm, logrando obtener del orden de platos/metro 10
11 Precolumnas o columnas de resguardo Son de relleno similar al de la columna analítica Tamaño de partícula mayor, para evitar caídas de presión Tipos de relleno Pelicular, bolas de vidrio o polímero En la superficie de las bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, resina sintética (poliestirenodivinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico. Estos rellenos se suelen utilizar en las precolumnas Partícula porosa, micropartículasporosas con diámetros de 3 a 10 µm Sobre las partículas también se deposita una capa delgada de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico, siendo la sílice la mas común en HPLC Detectores Adecuada sensibilidad Estabilidad y Reproducibilidad Respuesta lineal en un rango amplio Tiempo de respuesta corto Fiabilidad y manejo sencillo Respuesta semejante para todos los solutos e idealmente selectiva No destructivo 11
12 Detectores Basados en propiedad del soluto AbsorbanciaUV Fluorescencia Corriente límite Basados en propiedad de la disolución (fase móvil) Índice de refracción Constante dieléctrica Densidad Detectores de Absorbancia P T = P 0 A= log T A = log P 0 / P = abc P0 A= log P Detectores de Absorbancia Existen los de Filtros y los Monocromadores Filtros, aisla una línea intensa por medio de filtros: 254, 250, 313,334 y 365 nm Monocromadores, se puede hacer un barrido de longitudes de onda (detectores de arreglo de diodos) 12
13 Esquema de una celda de flujo en forma de Z DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN Un detector de índice de refracción (IR) es el detector de uso más universal. El índice de refracción de un compuesto es función de su densidad molecular. Una variación de la densidad se traduce en un cambio en el índice de refracción. Un refractómetro es sensible a: - Cambios en la concentración de la muestra o del disolvente - Cambios de presión y temperatura. Detectores de Fluorescencia Estado Singlete Fundamental Estado Singlete Excitado Estado Triplete Excitado F = K C solo cuando εbc
14 Detectores Electroquímicos Se basan en la oxidación o reducción de los compuestos eluídos frente a un electrodo Alta sensibilidad, sencillez, selectividad y extensa aplicabilidad Grupos funcionales orgánicos detectables potencialmente por medidas amperométricas 14
15 Detectores de conductividad Se mide continuamente la conductividad específica del eluyente, por lo tanto la presencia de muestra provoca un cambio en la conductividad de la fase móvil. Con este detector sólo se puede trabajar en sistema isocrático. Una de las desventajas de este detector es la inestabilidad de la celda. DETECTORES Absorbancia Fluorescencia Electroquímico Índice de Refracción Conductividad APLICACIÓN Cromóforos, compuestos que absorben luz Fluoróforos, selectivo Selectivo para compuestos electroactivos Universal, mide cambios en el IR Específico para todos los iones DETECTORES HPLC Absorbancia Fluorescencia Electroquímico Índice de Refracción conductividad LÍMITES DE DETECCIÓN 10 pg 10 fg 100 pg 1 ng 100 Pg- 1 ng 15
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