DETERMINACIÓN DE BHA- BHT-PG-NDGA EN ALIMENTOS Método DAD-UV-HPLC ME
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- Manuela Pinto Alvarado
- hace 6 años
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1 Página 1 de 7 1. OBJETIVO Determinar la concentración de Butil hidroxianisol (BHA), Butil hidroxitolueno (BHT), Propilgalato (PG) y Ácido Nordihidroguayaretico (NDGA) en materias grasas y muestras de alimentos con alto contenido de materia grasa por HPLC. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a alimentos sólidos y líquidos que contengan alto contenido de materia grasa como aceites y margarinas. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de los antioxidantes con una mezcla de acetonitrilo: 2 propanol: etanol en proporción (2:1:1) y previa separación del agua con tiosulfato de sodio anhidro. Los antioxidantes son separados, identificados y cuantificados por cromatografía liquida de alta resolución y con detector de arreglo de diodos a 280 nm. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 Food Additives Analytical Manual A.O.A.C. FDA Vol I, USA, Yokohama Quarantine Station, Japón. 5. TERMINOLOGÍA 5.1 BHA. Butil-hidroxianisol 5.2 BHT. Butil-hidroxitolueno 5.3 PG. Propilgalato 5.4 NDGA. Nordihidroguayaretico 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Estándar de BHA Estándar de BHT Estándar de PG DUEÑO DE PROCESO: Encargado de Química de ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento
2 Página 2 de Estándar de NDGA Acetonitrilo calidad p.a o superior Propanol p.a Etanol p.a Metanol grado HPLC Sulfato de Sódio anhidro p.a INSUMOS Columna: ODS (4.6mm x 15 cm) Dispositivo de filtración al vacío para membrana Millipore Embudos Espátula Embudos de separación Tubos de centrifuga Matraces aforados de color ámbar de 100 ml Membranas de 0,45 um Papel filtro N 5 A Navecillas Material usual de laboratorio. 6.3 EQUIPOS Rotavapor Refrigerador Cromatógrafo líquido con detector DAD Centrifuga. 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES 7.1 Muestreo/Muestra El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el Instructivo de Aceptación o Rechazo de muestras IT
3 Página 3 de Preparación de Reactivos Estándares Solución stock de NDGA de 1mg/mL (1000 ug/ml) Pesar 100 mg de NDGA en un matraz de 100 ml color ámbar, disolver y aforar con metanol Solución stock de PG de 1mg/mL (1000 ug/ml) Pesar 100 mg de PG en un matraz de 100 ml color ámbar, disolver y aforar con metanol grado HPLC. Solución stock de BHT de 1mg/mL (1000 ug/ml) Pesar 100 mg de BHT en un matraz de 100 ml color ámbar, disolver y aforar con metanol Solución stock de BHA de 1mg/mL (1000 ug/ml) Pesar 100 mg de BHA en un matraz de 100 ml color ámbar, disolver y aforar con metanol En todos los casos considerar % de pureza del estándar para calcular la concentración final Soluciones Fase móvil A: agregar 50 ml de ácido acético en un matraz de 1000 ml y llevar a volumen con agua desionizada. Fase móvil B: para un litro, mezclar 500 ml de acetonitrilo con 500 ml de metanol. Acetonitrilo/2-propanol/etanol en proporción de (2:1:1): para un litro, mezclar 500 ml de acetonitrilo con 250 ml de 2-propanol y 250 ml de etanol. 7.3 Preparación de curva de calibración Dependiendo el propósito se pueden efectuar las Curva de trabajo por separado o bien una mezcla de ellas de concentraciones de 1.0, 10, 20, 100 ug/ml. Realizar los puntos de calibración en matraces color ámbar y llevar a volumen con metanol Concentración ug/ml Alícuota ml Volumen final ml Concentración inicial ug/ml
4 Página 4 de Preparación de controles Preparar un spike y extraer del mismo modo que una muestra normal según se describe en Preparación de la Muestra o etapas previas a realizar la medición Los antioxidantes BHA, BHT, PG y NDGA son sensibles a la luz, por lo que se recomienda trabajar con material de color ámbar Homogeneizar la muestra mezclando o moliendo cuando se requiera. La mantequilla fundir a 40 C. Muestras sólidas Pesar + 5 g de muestra en un tubo de centrifuga de 50 ml Adicionar 40 ml de solución mixta de Acetonitrilo/2-propanol/etanol en proporción de (2:1:1) Agregar 10 gramos de Na 2SO 4. Homogeneizar y agitar 10 minutos. Refrigerar una hora o más a una temperatura no superior a 5 C. Filtrar con papel filtro. Lavar el residuo 3 veces con solución mixta de acetonitrilo/2-propanol/etanol (2:1:1) en proporciones de 5 ml. Concentrar el filtrado en rotavapor hasta 1 a 2 ml de volumen final. Llevar el residuo a un matraz de 5 ml y aforar con solución mixta acetonitrilo/2- propanol/etanol (2:1:1). Filtrar por filtro de 0.45 m Las soluciones están listas para inyectar en HPLC. Aceite Homogeneizar la muestra y pesar 5 gramos. Adicionar 40 ml de la solución Acetonitrilo/2-propanol/etanol (2:1:1). Homogeneizar y agitar 10 minutos. Refrigerar una hora o más a la temperatura de 5 C o menor. Filtrar con papel filtro.
5 Página 5 de 7 Lavar el residuo con solución mixta de acetonitrilo/2-propanol/etanol (2:1:1) 3 veces con 5 ml cada vez. Concentrar el filtrado en rotavapor a un volumen final entre 1 a 2 ml. Redisolver el residuo y aforar a 5 ml con la solución mixta acetonitrilo/2-propanol/etanol (2:1:1). Filtrar con filtro de 0,45 m. Las soluciones están listas para inyectar en HPLC. 7.6 Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales Fase móvil A: ácido acético al 5% Fase móvil B: acetonitrilo:metanol (1:1) Volumen de inyección: 10 ul Tiempo de corrida: 30 minutos. Columna: C18 (5 um x 4,6 mm x125 mm) Pre Columna RP -18 (5 um) 4-4 Temperatura de columna: 40 C Flujo: 1.0 ml/min. Detector: DAD a 280 nm Gradiente fase móvil: Tiempo (min) Solvente A % Solvente B% 7.7 Cálculo de Resultados: Realizar la curva de calibración utilizando el método de cálculo con estándar externo integrado en el equipo. Abrir el método antioxidantes ubicados en el HPLC que contiene la curva de calibración obtenida en concentración de ug/ml e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área v/s concentración. Inyectar en duplicado la curva de calibración y las muestras. Para obtener la concentración de antioxidantes en g/kg utilizar la formula siguiente:
6 Página 6 de 7 c x v g /kg. = w x 1000 Dónde: c = concentración en ug/ml obtenidos por la interpolación en la curva de calibración de la muestra del antioxidante analizado. v = volumen de la muestra final en ml w = masa de la muestra en gramos 7.8 Aseguramiento de la calidad del ensayo. Se efectuarán los siguientes controles para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. Durante el desarrollo de cada serie de trabajo se incluye: - Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica - Control de estándar de concentración conocida - Muestra con Spike de control para ver recuperación. Según la siguiente tabla: Set de muestras Nº de blancos Nº fortificados Estándar de concentración conocida o mas Expresión de los Resultados. Los resultados se informarán en g/kg con un límite de detección de g/kg. 8. CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO Registro de análisis proximal e Encargado de laboratorio de Nutrientes, ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE 5 años Papel LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION Laboratorio de Nutrientes, Aditivos y. / DISPOSICION Después de 5 años, basura y/o
7 Página 7 de 7 alimentos RG Aditivos y Libro anillado y foliado reciclaje de papel blanco. Registro preparación de soluciones de estándares puros RGG Registro preparación de mezclas de soluciones estándares RGG Encargado de laboratorio de Nutrientes, Aditivos y Encargado de laboratorio de Nutrientes, Aditivos y 5 años Papel 5 años Papel Laboratorio de Nutrientes, Aditivos y. / Libro anillado y foliado Laboratorio de Nutrientes, Aditivos y. / Libro anillado y foliado Después de 5 años basura y/o reciclaje de papel blanco. Después de 5 años basura y/o reciclaje de papel blanco. 9. CONTROL DE CAMBIOS VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES 3 Todos Cambio de Formato. El documento pasa de PRT a Se incluye la preparación de fases móvil. 3 8 Se modifica la identificación del primer registro. 10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES Ejecuta el método Técnico de Laboratorio Encargado de Laboratorio Nutrientes Aditivos y Elabora el informe de resultados Profesional encargado del Laboratorio Aprueba el informe de resultados Jefatura de Sub departamento Alimentos y Nutrición 11. ANEXOS No Aplica.
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