Curso Química Analítica Cualitativa
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- Eva María Muñoz Ayala
- hace 6 años
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1 TERMINOLOGÍA CROMATOGRÁFICA Curso Química Analítica Cualitativa Jorge Yáñez S Depto. de Química Analítica e Inorgánica Facultad de Ciencias Químicas Universidad de Concepción 1
2 TERMINOLOGÍA CROMATOGRÁFICA Etapas de una cromatografía: Siembra o inyección de muestra Elución de fase móvil y solutos Detección de componentes separados Siembra o inyección de solutos en mezcla Detección de solutos en orden de salida Eluyente o fase móvil Fase Estacionaria (separación de solutos) Elución de solutos separados 2
3 Siembra o inyección La siembra o inyección de la muestra corresponde a la incorporación de la mezcla de solutos dentro del sistema fase móvil-fase estacionaria. Se siembra en unidades de volumen, por ejemplo ml o µl. Ejemplos: En una cromatografía planar como la cromatografía en capa fina o papel la muestra se siembra sobre la fase estacionaria en la parte inferior del papel o poco sobre el nivel inicial de la fase móvil que asciende por efecto de impregnación. En una cromatografía en columna la muestra se siembra en la parte superior de la columna y luego se agrega la fase móvil que desciende a través de la columna por gravedad. 3
4 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Pipeta de siembra Fase estacionaria papel Fase móvil líquida CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Pipeta: siembra de muestra muestra con 2 solutos Columna abierta rellena con Fase estacionaria Filtro salida de solvente y solutos solvente solvente soluto 1 soluto 2 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA CERRADA Flowrate: 2 ml/min columna cerrada rellena con fase estacionaria Fase móvil o solvente bomba impulsora de fase móvil válvula de injección salida de solvente y solutos 4
5 Elución Proceso que consiste en hacer pasar la fase móvil (líquido o gas) a lo largo de la fase estacionaria Su fin es arrastrar los solutos a través de la columna y finalmente sacarlos de ella. El consumo de fase móvil o eluyente durante este proceso se mide en flujo, es decir volumen por unidad de tiempo, por ejemplo, 1 ml/min. La elución se puede realizar usando un solvente o una mezcla de solventes miscibles que permita la separación óptima de los solutos. Muy importante en su capacidad de elución de la fase móvil es: - composición química (polaridad) - ph - flujo Estas variables que deben ser optimizadas experimentalmente. 5
6 Forma de elución según el tipo de Cromatografía: 1. Cromatografía en capa fina: la elución es por impregnación de la FM en FE. 2. Cromatog. en columna abierta: la elución se produce por descenso de la FM a través de la FE, simplemente por gravedad. 3. Cromatog. en columna cerrada: la elución se produce al ser la FM impulsada mediante una bomba través de la FE. 6
7 Detección Consiste en la demostración de la presencia del soluto en el eluido mediante alguna evidencia física de éste. Ejemplo: Propiedad óptica como color (absorción de luz), fluorescencia, refracción de luz Propiedad eléctrica como carga (conductividad). Los detectores entregan una respuesta eléctrica (voltaje o corriente) al detectar los solutos que salen en el eluido (voltaje v/s tiempo). Esta respuesta es proporcional a la concentración del soluto detectado y puede ser representada gráficamente dando origen a un cromatograma. 7
8 Los detectores más comunes usados en cromatografía líquida son: a) Detector ultravioleta - visible, Detecta compuestos coloreados o que absorven luz en el rango ultravioleta o rango visible del espectro. b) Detector de fluorescencia c) Detector refractométrico, d) Detector de conductividad Detecta compuestos fluorescentes. mide índice de refracción de los compuestos, que es una característica específica de cada compuesto, por ejemplo en identificación de azúcares. Detecta compuestos con carga eléctrica o conductores. 8
9 Características fundamentales de un sistema de detección: Sensibilidad : Respuesta de un detector a una cantidad dada de analito. La sensibilidad es una medida relativa que depende de las condiciones de medida. Limite de detección: concentración mínima de un analito que puede ser determinada por un detector. Según IUPAC corresponde 3 veces la desviación estándar de los valores de 30 determinaciones del blanco, donde la concentración del analito es cero. Selectividad: Capacidad de un detector o un reactivo de responder a la presencia de un soluto o un tipo se solutos específicos. Rango lineal: Rango de concentración de un analito donde la respuesta del detector es proporcional a una variación de la concentración (normalmente incrementos de 5%). 9
10 El límite de detección puede ser informado de dos formas: Límite de detección relativo: expresado en base a una concentración. Por ejemplo, la concentración mínima detectable de cloruro en agua de regadío por cromatografía iónica es 10 ng/ml (ppb). Límite de detección absolutos: expresado en base a una cantidad. Por ejemplo, la cantidad mínima detectable de cloruro en agua de regadío por cromatografía iónica es 1 ng, ya que se inyecta 0,1 ml de muestra para el análisis. 10
11 CROMATOGRAMA Un cromatograma es la presentación gráfica de los compuestos después que éstos han sido separados en la fase estacionaria y el proceso de elución ha sido terminado. Tipos de Cromatográmas: 1. Cromatografía planar: El cromatograma estará dado por los compuestos separados en función de la distancia recorrida en la fase estacionaria por cada uno de ellos. Este tipo de cromatogramas o revelados son típicos de la cromatografía en capa fina o en papel, donde el cromatograma será envidenciado después de aplicar un reactivo colorante. El reactivo revelador reacciona con todos los solutos separados y forma productos coloreados sobre la fase estacionaria claramente distinguibles sobre la placa o papel. 11
12 Por ejemplo: el sulfuro de hidrógeno con metales por formación de sulfuros insolubles y coloreados. En este caso el cromatograma será más bien un revelado de los solutos (a) cromatograma revelado en papel Punto de siembra frente del solvente (b) cromatograma en función de distancia 0 distancia desde el punto de partida, cm 12
13 2. Cromatografía en columna Los compuestos que salen de la columna son detectados en el líquido eluido. El detector del sistema, se encuentra a la salida de la columna y genera una señal o respuesta en función a la concentración de cada soluto detectado en el líquido eluido. Como tiempo inicial (t 0 ), se considera al momento de la introducción de la muestra al sistema cromatográfico y se termina cuando se eluye el último compuesto separado desde la columna. Al terminar el proceso de elución, el resultado gráfico de la salida de los compuestos separados es el cromatograma, donde se representa: respuesta o señal del detector v/s tiempo de elución. Obviamente el soluto que presenta menor afinidad por la fase estacionaria avanzará más rápido y saldrá primero de la columna siendo éste el primero en ser detectado por el detector. 13
14 4 Respuesta del detector cromatograma en función del tiempo frente del solvente tiempo de elución (salida de la columna), min Cada pico del cormatograma representa la elusión de un soluto separado desde la columna 14
15 Forma típica de un pico o peak cromatográfico y sus características. Los picos están representados por: la altura el ancho Altura y área son proporcionales a la concentración de soluto detectado. 15
16 INFORMACION CUALI Y CUANTITATIVA DEL CROMATOGRAMA Mediante el manejo dos datos del cromatograma se puede extraer valiosa información cualitativa para la identificación de los compuestos separados a través: - tiempos de retención identificación de compuestos - área del peak o su altura cuantificación de compuestos Tiempo de retención de los solutos Se define como el tiempo que demora todo soluto desde su inyección hasta la llegada al detector pasando por la columna. Cada soluto tendrá un tiempo de retención característico que identificará su comportamiento cromatográfico y lo diferenciará de los otros solutos. 16
17 Tiempo de retencion ajustado: T ra = T r = T r - t m T m = tiempo que demora en salir la fase móvil de la columna T r = tiempo que demora en salir el soluto disuelto en fase móvil de la columna En cromatografía en capa fina los solutos se caracterizan por su coeficiente de migración, para cuyo cálculo en vez de usar el tiempo como referencia se usa la distancia recorrida por los solutos con respecto al avance del solvente. Dicho valor se conoce con el nombre de coeficiente de migración (R f ). R f = distancia recorrida por el solvente distancia recorrido por el soluto R f es una característica de cada soluto a T, P, solvente y Q constante 17
18 TEORÍA DE PLATOS TEÓRICOS Trata de explicar la separación de compuestos en mezcla mediante la formación de sitios de equilibrio, en donde se producen los repartos de los solutos entre la fase móvil y estacionaria. Cada sitio de intercambio se llamará un plato, término que deriva de los platos de una columna de destilación, en donde se produce la condensación del líquido destilado (equilibrio líquido/gas). Un plato teórico en cromatografía está definido como un evento teórico en el cual se produce un equilibrio de intercambio (sitio de reparto), por ejemplo, 1 tubo en una extracción por solventes Como la cromatografía es un proceso contínuo se consideran segmentos imaginarios en la columna (fase estacionaria) donde se forman sitios de intercambio con su coeficiente de distribucion correspondiente. 18
19 Cada segmento imaginario o sitio de reparto es un plato teórico, definido como: AEPT = L / N AEPT L N = altura equivalente de platos teóricos = largo de la columna = segmento de la columna donde hay un equilibrio Normalmente una columna tiene muchos platos teóricos (miles) Mientras más platos teóricos tengan, mayor es su capacidad de separación de componentes, ya que un mayor número de sitios de reparto conlleva a una separación más efectiva. Las columnas modernas usan fases estacionarias con una gran cantidad de platos teóricos para lograr una eficiente separación de compuestos parecidos. Platos teóricos - sitios de intercambio - separación más efectiva 19
20 La gran cantidad de sitios de intercambio se ha logrado usando fases estacionarias soportadas en gránulos de pequeño tamaño, para así aumentar la superficie de contacto entre ambas fases Las columnas actuales presentan tamaños de rellenos tan pequeños (µm) en las columnas, la fase estacionaria opone una tremenda resistencia al paso de la fase móvil (resistencia al paso de un fluido). Por lo tanto es necesario aplicar altas presiones para vencer esta resistencia (> 100 atmósferas o bar). Estas condiciones extremas de pequeños tamaños de material de relleno, altas presiones y alta capacidad de separación, requiere el uso de sistemas altamente herméticos, resistente a altas presiones y ambiente químico corrosivo. Debido a estas características se habla actualmente de la cromatografia líquida de alta eficiencia, que se abrevia (HPLC) del inglés High Preformance (Pressure) Liquid Chromatography. 20
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