MÉTODOS DE ESTUDIO DE PROTEÍNAS

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Juan Antonio Jiménez Ponce
hace 5 años
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1 MÉTODOS DE ESTUDIO DE PROTEÍNAS

2 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS Al estudiar la expresión de un gen puede analizarse el ARN (Northern blot, PCR a tiempo real, etc), y también la expresión de la proteína, mediante técnicas como el Western blot.

SDS-PAGE SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar proteínas desnaturalizadas en un gel de poliacrilmida en función de su tamaño.

La mezcla que se indica es para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este porcentaje varía debe recalcularse la cantidad de acrilamida/bis y de agua

3 SDS-PAGE SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar proteínas desnaturalizadas en un gel de poliacrilmida en función de su tamaño. Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica es para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este porcentaje varía debe recalcularse la cantidad de acrilamida/bis y de agua destilada a añadir. Mezcla para gel separador: Acrilamida/bis 40% 9 ml Tris-HCl 1,5 M ph 8,5 7.5 ml Agua destilada 13 ml 10% SDS 300 ml 10% APS 100 ml TEMED 15 ml Mezcla para gel concentrante: Acrilamida/bis 40% Tris-HCl 1M ph 6,8 Agua destilada 1 ml 1.25 ml 7.6 ml 10% SDS 100 ml 10% APS 35 ml TEMED 5 ml

4 SDS-PAGE Buffers y soluciones Tampón de electroforesis: 25 mm Tris, 192 mm Glicina, 0.1% SDS, ph 8.3 Tampón de muestra: 0.3 M Tris HCl, ph 6.8, 5% SDS, 50% glycerol, Azul de bromofenol 0.01%, 2-bmercaptoetanol 0,5% Solución de teñido: 0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético Solución de desteñido: 50% Metanol, 10% Ácido Acético

Tinción con plata 1- Etanol, ácido acético, H 2 O (30:10:60) 2- Etanol

5 SDS-PAGE Tinción con coomasie Solución de teñido: 0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético Tinción con plata 1- Etanol, ácido acético, H 2 O (30:10:60) 2- Etanol 30% 3- Nitrato de plata 0,1% 4- NaCl, CuSO 4, NH 4 OH, tiosulfato sódico 5- Ácido acético 1%

6 PAGE PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS - Cuando se pretende extraer una proteína del gel de forma que conserve su actividad, o bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimática en el propio gel, las proteínas no deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones: - No se añade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis - No se añade b-mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reducción de los puentes disulfuro - Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4ºC - Para ver actividad en el gel: éste se incuba con el sustrato adecuado hasta que aparezcan bandas de actividad Debe tenerse muy en cuenta el ph del gel, ya que las proteína entrarán y se moverán en el gel sólo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoeléctrico. - Si se quiere recuperar la actividad de una proteína despues de un SDS-PAGE existen protocolos para renaturalizar la proteína

7 Western Blot Detección de una proteína mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE

8 Western Blot Actividad de la enzima fosfatasa alcalina conjugada con el anticuepo secundario

9 Western Blot Reacción cruzada con anticuerpos policlonales

10 Western Blot Cuantificación de la proteína tras un Western blot como método de determinación de la expresión del gen

11 Técnicas de Proteómica Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE Isoelectroenfoque: separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico: ph al cual la carga neta total de la proteína es 0 SDS-PAGE: separación de las proteínas en función de su tamaño

12 Técnicas de Proteómica Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE Pueden llegar a detectarse todas las proteínas que se están expresando en una célula Permite establecer comparaciones entre dos condiciones: sistema de análisis de expresión diferencial

13 Técnicas de Proteómica Métodos de identificación de las proteínas Las proteínas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro método) pueden analizarse para conocer su masa molecular, huella peptídica y secuencias de péptidos internos en sistemas de espectrometría de masas; esto permite su identificación. - Huella peptídica: tras digestión con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todos los péptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la información de los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) - Para completar la identificación puede hacerse una microsecuenciación de péptidos internos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuencias de longitud corta (6-14 aminoácidos) que a menudo presentan ambigüedades. - Microsecuenciación por Degradación de Edman : Método clásico de secuenciación de péptidos. Requiere al menos 0,5 mg de proteína. Es un método más directo, pueden obtenerse secuencias de hasta aa, mayor fiabilidad.

14 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

15 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

16 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

17 Métodos de estudio y caracterización de proteínas Purificación de proteínas mediante la adición de un tag (etiqueta): epitope tagging - Permite la purificación mediante técnicas de afinidad, en un solo paso, de grandes cantidades de proteína para su análisis. Se requiere haber clonado previamente el gen. - La proteína de interés se expresa en E. coli como una proteína de fusión, con un tag, el cual permite purificarla eficientemente mediante afinidad.

18 Métodos de estudio y caracterización de proteínas Epitope tagging The expression vector pqe-30 Xa encodes a Factor Xa Protease recognition site between the N-terminal 6xHis-tag sequence and the multiple cloning site.

19 Métodos de estudio y caracterización de proteínas Epitope tagging. Ni-NTA resin interacts with histidines

20 Métodos de estudio y caracterización de proteínas Epitope tagging. Recovery of His-tagged protein from E. coli in diffeent culture times. 1- flowthrough, 2- firs elution, 3- second elution

21 Métodos de estudio y caracterización de proteínas - Actividades enzimáticas - Cristalografía de proteínas - Estudio de la localización celular de la proteína mediante fusión con la proteína GFP (Green Flurescent Protein) - Estudio de interacciones con otras proteínas: - Co-inmunoprecipitación - Far Western (rastreo de una genoteca de expresión con nuestra proteína marcada) - Sistema de dos híbridos - Bimolecular fluorescence complementation

22 Métodos de estudio y caracterización de proteínas - Búsqueda de proteínas/péptidos con capacidad de unirse a un ligando: Phage Display

23 CARACTERIZACIÓN DE LA FUNCIÓN GÉNICA

24 Caracterización de la función génica - Disrupción génica. Reemplazamiento génico por doble entrecruzamiento gena Southern Northern T14 T14

25 Caracterización de la función génica - ARN antisentido

26 Caracterización de la función génica - Site-directed mutagenesis: QuickChange - Primers entre nucleótidos, del mismo tamaño y complementarios - En su secuencia incorporan la mutación a introducir - Se obtienen moléculas de ADN circulares como producto de la amplificación, las cuales han incorporado la mutación - DpnI digiere solo el ADN metilado, el proveniente de la bacteria. El amplificado in vitro no está metilado y no se digiere. Incrementa la eficiencia de la técnica

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