INTRODUCCIÓN Las plantas y su respuesta frente a cambios ambientales..3

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1 INTRODUCCIÓN Las plantas y su respuesta frente a cambios ambientales Las Poliaminas como metabolitos reguladores de crecimiento, división y muerte celular Metabolismo de PAs Funciones de las PAs en plantas PAs en otros organismos y su importancia biomédica De la espermidina a la hipusinación del factor eif5a La ruta de hipusinación Estructura del factor eif5a Proteoformas del factor eif5a Localización subcelular de eif5a Otras modificaciones: fosforilación y ubicuitilación Dimerización del factor eif5a El factor EF-P: ortólogo de eif5a en eubacterias Estructura del factor EF-P Función del factor EF-P: traducción de secuencias con prolinas consecutivas Funciones moleculares del factor eif5a Papel de eif5a en la elongación de la traducción Papel de eif5a en la degradación de los ARNm.22

2 5.3. Implicación de eif5a en la formación de complejos de ribonucleoproteínas: cuerpos P y gránulos de estrés Implicación de eif5a en el transporte de ARNm eif5a y la traducción de proteínas con prolinas sucesivas Aspectos funcionales del factor eif5a en organismos eucariotas eif5a en levadura eif5a en mamíferos eif5a en plantas Hipusinación del factor eif5a, una caracterización complicada...37 OBJETIVOS 39 RESULTADOS Patrón de hipusinación del factor eif5a en A. thaliana Expresión heteróloga de las proteoformas recombinantes no modificadas de eif5a de A. thaliana Expresión heteróloga de las proteoformas recombinantes hipusinadas de eif5a de A. thaliana Caracterización del perfil 2D-E de eif5a de A. thaliana El ABA reduce la hipusinación de eif5a1 sin afectar a los niveles de transcrito de DHS Localización subcelular de las proteínas eif5a Estudios de interacción entre las isoformas de eif5a de A. thaliana in vivo 66

3 2. Función del factor eif5a en A. thaliana Generación de un sistema inducible de desactivación de eif5a en A. thaliana Validación del silenciamiento por ARNi de DHS, eif5a1, eif5a2 y eif5a Generación de plantas transgénicas sidhs, sieif5a1, sieif5a2 y sieif5a3 y comprobación del silenciamiento Caracterización de las líneas de desactivación condicional a lo largo del desarrollo Implicación del factor eif5a en el control del tiempo de floración Implicación del factor eif5a en el desarrollo de la arquitectura del tallo Implicación del factor eif5a en el desarrollo del xilema Implicación del factor eif5a en el desarrollo de la raíz Caracterización de las líneas sidhs en respuesta a diferentes estímulos externos, e interacción con otros procesos de señalización Implicación del factor eif5a en la señalización por ABA Implicación del factor eif5a en el control de los niveles de NO Implicación del factor eif5a en respuesta a factores externos Dianas moleculares de eif5a Estudio bioinformático de las proteínas con 3 o más prolinas sucesivas en eucariotas Estudio de los ARNm diana del factor eif5a, implicados en la organización del citoesqueleto Estudio de la implicación del factor eif5a en el control de la organización del citoesqueleto en A. thaliana.125

4 Estudio de los ARNm diana del factor eif5a, implicados en la organización del citoesqueleto en S. cerevisiae Estudio de los ARNm diana del factor eif5a, implicados en la organización del citoesqueleto en H. sapiens Estudio de los ARNm diana del factor eif5a, implicados en el control del tiempo de floración en A. thaliana Detección de los ARNm que interaccionan físicamente con eif5a in vivo..158 DISCUSIÓN Necesidad de un sistema de monitorización de la hipusinación Funciones de eif5a en el desarrollo de A. thaliana Implicación de eif5a en la organización del citoesqueleto de actina EF-P y eif5a como mecanismos de control de calidad de la traducción..179 CONCLUSIONES MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico, manipulación y condiciones de crecimiento Escherichia coli Medios de cultivo y temperatura de crecimiento Transformación de E. coli Electroporación...189

5 Choque térmico Agrobacterium tumefaciens Medios de cultivo y temperatura de crecimiento Transformación de A. tumefaciens Sacharomyces cerevisiae Cepas Medios y condiciones de crecimiento Tratamiento con factor α Arabidopsis thaliana Cultivo in vitro Medios de cultivo Esterilización y siembra de las semillas Condiciones de crecimiento in vitro Tratamiento con dexametasona Tratamientos con ABA Tratamiento con sal (NaCl) y glucosa Tratamiento con 4-EGI Cultivo en el invernadero Sustrato, siembra y condiciones de crecimiento Tratamiento con dexametasona Transformación por agro-infección Nicotiana benthamiana Cultivo y condiciones de crecimiento Agro-transformación, expresión transitoria y BiFC 197

6 Tratamiento con dexametasona Homo sapiens Línea celular, medios de cultivo y condiciones de crecimiento Tratamiento con GC Transfección con sieif5a Técnicas de análisis y manipulación de ácidos nucleicos Extracción del ADN plasmídico (ADNp) de E. coli Reacciones de PCR Técnicas de clonación Clonación GATEWAY TM Reacción BP Reacción LR Clonación LIC Extracción del ARN total de A. thaliana Electroforesis de ácidos nucleicos (ADN y ARN) Reacciones de transcripción reversa PCR cuantitativa a tiempo real (qpcr) Técnicas de análisis y manipulación de proteínas Expresión heteróloga en E. coli y purificación de las proteínas recombinantes Extracción de proteínas de S. cerevisiae Extracción de proteínas de A. thaliana Extracción de proteínas en H. sapiens...213

7 3.5. Electroforesis SDS-PAGE D-E D-E Marcaje con fluoróforos y escaneado de la fluorescencia Tinción Coomassie Tinción con nitrato de plata Análisis WB Digestión con tripsina, MALDI-TOF-MS y GCxGC/TOF-MS Análisis de polisomas A. thaliana H. Sapiens Procesado y análisis de las fracciones Inmunoprecipitación de ARN (RIP) Fraccionamiento núcleo-citosol Inmunoprecipitación Extracción del ARN inmunoprecipitado Síntesis de ADNc SMART TM y amplificación por PCR Clonación en pentr1a-sfii Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) Análisis de la tasa de traducción in vivo mediante Click chemistry Incorporación del AHA...228

8 7.2. Reacción de Click Purificación de las proteínas biotiniladas Análisis WB y cálculo de la tasa de incremento Técnicas de microscopía A. thaliana Recuento de tipos celulares del xilema en hipocotilos Cortes de hipocotilo para tinción histoquímica Tinción con yoduro de propidio Detección de NO Visualización del citoesqueleto de actina N. benthamiana: experimentos de expresión transitoria y BiFC H. sapiens Tinción con rodamina-faloidina y DAPI Inmunofluorescencia indirecta.235 BIBLIOGRAFÍA ANEXO Figuras suplementarias Listado de acrónimos y abreviaturas...270

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