Introducción General 1

Transcripción

1 Índice General I Introducción General 1 1. Alimentos funcionales Probióticos y prebióticos como componentes de alimentos funcionales Probióticos Prebióticos 3 2. El kefir: un ecosistema bacteriano complejo El kefir como alimento funcional Microorganismos presentes en el gránulo de kefir Componentes del gránulo de kefir: Biosíntesis Kefiran Propiedades tecnológicas del kefiran Funcionalidad biológica del kefiran 16 Objetivos 19 Materiales y Métodos Medios de cultivo Buffers comunes a varias metodologías Coloración de Gram Gránulos de kéfir utilizados Microorganismos de referencia. Condiciones de cultivo Microorganismos de la colección CIDCA. Condiciones de cultivo Metodología para el aislamiento de microorganismos de gránulos de kefir Disgregación de gránulos Cultivo y selección de microorganismos Reacción de la catalasa Producción de gas a partir de glucosa (10 g/l ) Capacidad de fermentar la leche Perfil de proteínas de célula entera por electroforesis en geles de poliacrilamida 28 desnaturalizantes (SDS-PAGE). 12. Obtención de ADN genómico de gránulos de gránulos de kefir Obtención de ADN genómico a partir de bacterias aisladas Obtención de ADN a partir de contenido intestinal y materia fecal 36 I

2 15. Determinación de la concentración de ADN Amplificación del ADNr 16S Electroforesis en gel de acrilamida con gradiente desnaturalizante (Denaturing 40 Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)) 18. Secuenciación Tipificación por rep PCR (GTG) Amplificación de secuencias repetidas: rep PCR Electroforesis en gel de agarosa Secuenciación del gen de la fenilalanina sintasa Amplificación del gen de la fenilalanina sintasa Control de los amplicones Purificación Reacción de amplificación para la secuenciación Purificación y Secuenciación Caracterización reológica de las leches fermentadas Obtención de leches fermentadas Obtención de geles lácteos acidificados con 53 δ-gluconolactona Evaluación del comportamiento de flujo y determinación de viscosidad Evolución del espectro mecánico de los geles ácidos Obtención y purificación de polisacáridos Extracción de exopolisacáridos de microorganismos aislados Extracción de exopolisacáridos de gránulos de kefir Cromatografía de capa fina Cuantificación de proteínas: Método de Bradford Cuantificación de azúcares totales: Método de antrona Caracterización de exopolisacáridos Determinación de peso molecular Composición de azúcares mediante cromatografía de intercambio aniónico Hidrólisis para la determinación de azúcares Cromatografía de intercambio aniónico Efecto de polisacáridos sobre la microflora fecal de ratones Animales de laboratorio Soluciones de polisacáridos Tratamiento 1: Diseño del Experimento Análisis de las muestras de contenido intestinal Tratamiento 2: Diseño del Experimento Análisis de las muestras de material fecal Recuento de lactobacilos y bifidobacterias 64 II

3 Peso de los ratones PCR-DGGE Análisis mediante hibridación fluorescente in situ- Citometría de flujo Microscopía laser confocal 68 Capítulo 1 Aislamiento e Identificación de Microorganismos de Gránulo de Kefir. Introducción Identificación de microorganismos en comunidades microbianas complejas Métodos para el estudio de comunidades microbianas: electroforesis 69 dependientes de la secuencia Extracción del ADN Amplificación Electroforesis Análisis de datos Taxonomía El género Lactobacillus Lb kefiranofaciens: características generales y su importancia en el ecosistema 80 del kefir. Objetivos 83 Resultados y Discusión Aplicación de métodos independientes de cultivo para estudiar la presencia de Lb 84 kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens en gránulos de kefir. 2. Aislamiento e identificación de Lb kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens de 95 gránulos de kefir Aislamiento Identificación de los aislados obtenidos Caracterización fenotípica: Coloración, morfología de colonia, producción de 99 gas a partir de glucosa y capacidad para fermentar la leche Caracterización fenotípica: Perfil de proteínas totales por SDS-PAGE Características genotípicas: Amplificación de secuencias repetitivas Características genotípicas: Secuenciación del gen que codifica el trna de la 113 fenilalanina sintasa (phes) Perfil obtenido por electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante 115 químico (DGGE) de los microorganismos aislados de gránulo de kefir y secuenciación del ADNr 16S Conclusiones 128 III

4 Capítulo 2: Selección de Lactobacilos Productores de Exopolisacáridos. Introducción Bacterias lácticas productoras de exopolisacáridos en la industria de alimentos Características y clasificación de polisacáridos producidos por bacterias ácido 131 lácticas Rol fisiológico de exopolisacáridos bacterianos Producción de exopolisacáridos por bacterias ácido lácticas Cuantificación de los exopolisacáridos producidos por bacterias lácticas Selección de bacterias productoras de exopolisacáridos Formación de geles lácteos ácidos Interacción exopolisacárido-proteína en geles lácteos Propiedades de los exopolisacáridos en solución acuosa Evaluación de las características reológicas de geles lácteos Viscosimetría rotacional Viscosimetría oscilatoria de pequeña amplitud de deformación 145 Objetivos 148 Resultados y Discusión Selección de cepas productoras de polisacáridos Efecto del ph de las leches fermentadas sobre la viscosidad aparente y el área de 150 histéresis Comportamiento de flujo de leche acidificada con δ-gluconolactona y leches 151 fermentadas con Lb delbrueckii subsp. bulgaricus y Lb kefiranofaciens subsp kefiranofaciens Comportamiento de flujo de las leches fermentadas con los microorganismos 154 aislados de kefir Lactococcus lactis subsp. lactis Lactobacillus plantarum Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens Lactobacillus paracasei Caracterización de las leches fermentadas mediante reometría oscilatoria de 165 pequeña amplitud de deformación. 3. Aislamiento y caracterización de polisacáridos Cuantificación de la producción de polisacáridos durante la fermentación de la 171 leche Peso molecular de los polisacáridos Caracterización de los polisacáridos producidos por Lactobacillus paracasei 180 IV

5 Conclusiones 183 Capítulo 3 Efecto de Polisacáridos Bacterianos sobre el Balance de la Microflora Intestinal de Ratones. Introducción Composición de la microflora intestinal humana Función de la microflora intestinal Componentes benéficos de la microbiota intestinal El concepto de prebióticos Regulación de la microbiota intestinal por la dieta mediante el uso de prebióticos Exopolisacáridos de bacterias lácticas como prebióticos Metodologías para el estudio de la microbiota intestinal Hibridación fluorescente in situ- Citometría de flujo 195 Objetivos 200 Resultados y Discusión Efecto de la administración oral de kefiran sobre la microbiota intestinal de ratones Optimización de las condiciones para el análisis mediante PCR-DGGE Verificación de la especificidad de los oligonucleótidos empleados Selección de las condiciones de amplificación Selección de las condiciones de corrida para la Electroforesis en Gel con Gradiente 207 Desnaturalizante químico Análisis de la población de Eubacterias Estudio de las poblaciones de bifidobacterias y lactobacilos Efecto de la administración oral de kefiran sobre la evolución de la microbiota fecal de 218 ratones Evolución de poblaciones bacterianas en muestras de materia fecal Análisis de la evolución de la población de Eubacterias Evolución en los perfiles de bifidobacterias y lactobacilos Cuantificación de poblaciones bacterianas mediante hibridación in situ fluorescente y 224 citometría de flujo Puesta a punto del método. Especificidad de las sondas Cuantificación de poblaciones de lactobacilos y bifidobacterias mediante Hibridación in 225 situ fluorescente y citometría de flujo. 3.-Efecto de la administración oral del polisacárido producido por Lb paracasei CIDCA sobre la evolución de la microbiota fecal de ratones Evolución de poblaciones bacterianas en muestras de materia fecal Evolución en los perfiles de bifidobacterias y lactobacilos 232 V

6 3.2.- Comparación del efecto del consumo de kefiran y del consumo del polisacárido 234 producido por el Lactobacillus paracasei CIDCA Peso de los ratones Recuento de microorganismos viables. 235 Conclusiones 238 Conclusiones Generales 241 Referencias Bibliográficas 247 VI