ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

Transcripción

1 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

2 qpcr (PCR en tiempo real) Northern blot Western blot Gen reportero

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4 - Northern blot - Aporta información sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamaño - Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% y formaldehído 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfónico) - Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehído, colorante - Transferencia: por capilaridad o vacío, similar al Southern - Hibridación: similar al Southern, buffer con más formamida (50%) - Para comparar diferencias en los niveles de expresión de un gen es muy importante la utilización de un control: generalmente un gen que se exprese constitutivamente: citoesqueleto (g-actina), un gen de ARNr. Las intensidades de la señal del gen en estudio deben normalizarse con las del control

5 Esquema Transferencia: capilaridad, vacío Fijación Hiridación Lavados Exposición: film de autoradiografía o Phosphorimager

6 - RT-PCR - Tiene un mayor poder de detección que el Northern. Problema de los falsos positivos: tratar con DNAsa y realizar controles negativos en la RT-PCR. - Puede hacerse una RT-PCR semicuantitativa, mediante diluciones del molde y un control, no es muy precisa. - PCR tiempo real - Es una RT-PCR en la cual no se detecta cuanto cdna se acumula al final, sino que se va midiendo de continuo para determinar en que ciclo de la PCR se alcanza un valor umbral. Cuanto antes se alcance (número de ciclos más bajo) mayor será la concentración inicial del ARNm. Por comparación con un control (gen de expresión constitutiva) pueden determinarse las diferencias de expresión de un gen en diferentes tejidos, condiciones, poblaciones, etc. C T : Threshold cycle. Ciclo en el cual un incremento significativo de DRn es detectado por primera vez Rn+: Intensidad emisión en reacciones Rn-: Intensidad emisión en controles sin molde DRn: Rn+ - Rn-

7 - PCR tiempo real La cantidad de DNA se detecta mediante una sonda específica que hibrida con los fragmentos de DNA que se van amplificando y que lleva incorporado un fluorocromo en su extremo 5. En cada ciclo de amplificación la sonda emite fluorescencia cuando es desprendida por la polimerasa, la cual es detectada mediante láser por el termociclador. Este sistema detecta específicamente la amplificación de un determinado gen. También puede utilizarse SYBR green, que se une inespecífcamente a cualquier DNA que se esté amplificando

8 - PCR tiempo real

9 - PCR tiempo real

10 - PCR tiempo real, métodos de análisis - Cuantificación absoluta Esta técnica relaciona la señal obtenida con la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva de calibración. - Cuantificación relativa La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones determinadas. Lo que se calcula es la variación relativa de la expresión de un gen en una condición problema con respecto a una condición control (calibrador). Los resultados deben normalizarse con un gen de referencia cuya expresión no varíe entre las dos condiciones ensayadas.

11 - Cuantificación absoluta

12 - Cuantificación absoluta

13 - Cuantificación relativa - Método de PFAFFL: - E target : eficiencia en la amplificación del gen diana o target - E reference : eficiencia en la amplificación del gen referencia o control endógeno (p. ej. GAPDH) - ΔCP target (control-sample) : cambio en los valores de los ciclos umbral (CP = CT) del gen target entre la condición control (calibrador) y la condición experimental (sample) - ΔCP reference (control-sample) : cambio en los valores de los ciclos umbral (CP = CT) del gen de referencia (control endógeno) entre la condición control (calibrador) y la condición experimental (sample) - R: tasa de variación relativa de la expresión del gen diana entre la condición control y la condición experimental

14 - Cuantificación relativa - Método del Ct comparativo: 2 DDCt 2 [DCt (muestra) DCt (calibrador)] -ΔCt (muestra): diferencia entre el valor del ciclo umbral del gen target y el del gen de referencia en la condición experimental - ΔCt (calibrador): diferencia entre el valor del ciclo umbral del gen target y el del gen de referencia en la condición control (calibrador) - Este método requiere que la eficiencia de amplificación de los genes diana y referencia sea idéntica

15 - Utilización de genes reporter - Medir directamente el ARN o el cdna, bien a través de Northern bien a través de PCR, implica trabajar con ARN: difícil manipulación, dificultad en la detección y cuantificación. - La utilización de genes reporter (genes testigo) evita trabajar con ARN, y permite cuantificaciones muy precisas de los niveles de ARN por métodos sencillos. - Un gen reporter es un gen que acoplamos al promotor que pretendemos estudiar y que codifica una proteína que posee una actividad fácil de detectar y medir. - Genes utilizados como reporter: - lacz de E. coli, codifica una b-galactosidasa: usando ONPG (orto-nitrofenil-b-dgalactopiranósido) como sustrato produce color amarillo que absorbe a 420 nm - GUS de E. coli, codifica una b-glucuronidasa: usando como sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indoilb-D-glucuronido se genera un producto coloreado. Se utiliza mucho en plantas. - CAT del transposón Tn9 de E. coli, cloramfenicol acetiltransferasa: detección de cloramfenicol marcado con 14 C mediante TLC (thin layer chromatography) - Gen de la Luciferasa: cataliza la oxidación de luciferina, en una reacción que requiere ATP y oxígeno, emitiendo una luz verde-amarillenta - Gen de la Fosfatasa alcalina: actividad detectable mediante reacción colorimétrica o luminiscente. - GFP, Green Fluorescent Protein: autofluorescente, no necesita sustrato. Se usa en localización intracelular de proteínas, fusionando la GFP a la proteína en estudio en este caso.

16 - Utilización de genes reporter