BACKGROUND HISTORICO

Transcripción

1 INTRODUCCIÓN N A LA TÉCNICA T DE PCR EN TIEMPO REAL DRA. ADRIANA A. GIRI LABORATORIO DE VIROLOGÍA HUMANA IBR - CONICET FACULTAD DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO 2013

2 BACKGROUND HISTORICO David Baltimore y Howard Temin descubren de manera independiente la enzima Transcriptasa Reversa codificada por el Rous Sarcoma Virus (RSV), un retrovirus. Cae el Dogma Central de la Biología: DNA RNA PROTEINA Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, EE.UU.) informan la aparición de casos de neumonía y sarcoma de Kaposi, en hombres jóvenes y homosexuales. Empieza la era del SIDA Luc Montagnier y Francois Barré-Sinoussi (Francia) y Robert Gallo (EE.UU.) aislan de manera independiente un retrovirus de los linfocitos de pacientes con SIDA. Empieza la era del HIV Kary Mullis (Cetus Corp.) mientras conducía su auto a altas horas de la noche con su novia, tuvo una idea: copiar una cadena corta de ADN un número infinito de veces con un par de los cebadores que delimitaran una secuencia y una ADN polimerasa. Empieza la era de la Polymerase Chain Reaction o PCR

3 Reacción n en Cadena de la Polimerasa Science 1985;230: Saiki et al Saiki et al Stratagene ADN polimerasa de Escherichia coli Termosensible: había que agregar enzima fresca luego de cada ciclo ADN polimerasa de Thermus aquaticus (aguas termales) Taq Polimerasa Termoestable Deja overhangs de A en 3 No posee proofreading (1 error/ nt) ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus Pfu Polimerasa Termoestable Produce extremos romos Posee proofreading (1 error/ nt)

4 Reacción n en Cadena de la Polimerasa Science 1985;230: Kary Mullis Premio Nobel en Química 1993

5 AMPLIFICACIÓN N DE ÁCIDOS NUCLEICOS: Polymerase Chain Reaction Amplificación Génica Detección de Amplicones

6 PCR: VARIACIONES DE LA TÉCNICAT RT - PCR PCR Anidada o Nested RT PCR 1º ciclo sigue PCR

7 PCR: VARIACIONES DE LA TÉCNICAT Hanging Droplet PCR o PCR de la Gota Colgante Aceite mineral Mix II hanging droplet Long PCR Long PCR Copies/reaction Copies/reaction RC Kb RC Mix I + Muestra 4,300 bp centrifugación 1º ronda de amplificación: 20 Ciclos 2º ronda de amplificación: 40 Ciclos 390 pb 3 5

8 PCR: VARIACIONES DE LA TÉCNICAT RT- PCR Anidada - Multiplex Análisis de la presencia de distintos target en la misma muestra: RNA del macerado de brotes de árboles de oliva. Varios cebadores específicos para 4 targets: 1. Cucumber mosaic virus (CMV) 2. Cherry leaf roll virus (CLRV) 3. Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) 4. Arabis mosaic virus (ArMV) Nested-RT PCR multiplex: 8 pares de cebadores en total (4 pares internos y 4 externos) Detección colorimétrica: por dot blot con sondas específicas para cada virus

9 Como conocer las PCR CUANTITATIVA las copias originales presentes en la muestra? Y = Y 0 (1 + e) n log Y = log Y 0 + n log (1+e) Y: producto final Y 0 : Target inicial e: eficiencia de la reacción n: número de ciclos

10 PCR: CINÉTICA DE LA REACCIÓN Y = Y 0 (1 + e) n log Y = log Y 0 + n log (1+e) Y: producto final Y 0 : Target inicial e: eficiencia de la reacción n: número de ciclos

11 Exponencial: e = 1 (1+e) = 2 2 n 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 ciclo: log Y = log Y 0 + n log (1+e) Lineal: e < 1 (1+e) = n 1.5, 2.2, 3.4, 5, 7.6, 11.4, 17 ciclo: Plateau: e ~ 0 (1+e) = 1 1 n 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 ciclo:

12 CINÉTICA DE LA REACCIÓN N DE PCR Y = Y 0 (1 + e) n Escala Aritmética Escala Logarítmica

13 PCR EN TIEMPO REAL: Los Albores Bromuro de Etidio en cada muestra Termociclador: adaptado para irradiar con UV Video camera: Detección de fluorescencia PC: captura y analisis de resultados Lectura: fase de annealing/sintesis en cada ciclo

14 PCR EN TIEMPO REAL: Los Albores Señal Fluorescente Vs. Número de Ciclos Log N copias originales Vs. N de Ciclos Mayor es el número de copias del target presentes en la muestra inicial, menor cantidad de ciclos serán necesarios para producir una fluorescencia detectable. Existe una relación lineal entre el número de copias de ADN presentes originalmente en la muestra y el número de ciclos requeridos para alcanzar el nivel de fluorescencia establecido arbitrariamente o threshold (umbral).

15 GRÁFICO REPRESENTATIVO DE AMPLIFICACIÓN Threshold: umbral C T : Ciclo umbral

16 La cuantificación del DNA presente originalmente en la muestra debe hacerse en la región lineal de la curva (escala logarítmica) Escala Aritmética Escala Logarítmica

17 La cuantificación del DNA presente originalmente en la muestra debe hacerse en la región lineal de la curva (escala logarítmica) Escala Aritmética Escala Logarítmica El punto en que la fluorescencia acumulada en la muestra cruza el UMBRAL se llama CICLO UMBRAL (CT: Cycle Threshold). El CICLO UMBRAL es inversamente proporcional al número de copias del target a mayor concentración de target inicial, menor CT medido.

18 La cantidad del producto amplificado en la fase exponencial (parte lineal de la curva en escala logarítmica) va a depender exclusivamente del ciclo en la que su detección se hace posible. La cantidad de DNA o cdna presente inicialmente en la muestra, se calcula por regresión lineal con la curva standard (C T Vs. Log Número de copias)

19 REAL TIME PCR: Eficiencia de la reacción y = y 0 (e + 1) n y 0 = y /(e + 1) n log y 0 = log y - n log (1+e) log y 0 = log y t -c t log (1+e) en qpcr: y t & e ~ constantes La eficiencia es máxima en la fase exponencial de la reacción (parte lineal de la curva en escala logarítmica) La eficiencia de la reacción da la pendiente de cada curva cuando se traza en escala logarítmica. pendiente = - log (1+e)

20 PCR EN TIEMPO REAL RNA RT-PCR

21 REAL TIME PCR: Que se necesita?? TERMOCICLADOR PARA PCR EN TIEMPO REAL Sistema de detección capaz de captar, cuantificar y procesar la señal flourescente al final de cada ciclo de PCR y para cada muestra. SEÑAL FLUORESCENTE AGENTES INTERCALANTES SONDAS MARCADAS CON FUOROCROMOS

22 REAL TIME PCR: Equipos Lightcycler (Roche) Bio-Rad Smartcycler (Cepheid)

23 REAL TIME PCR: Agentes Intercalantes BROMURO DE ETIDIO, SYBR GREEN I, EVA GREEN Ventajas: Desventajas: barato, fácil de optimizar, universal baja especificidad (primer dimers, productos inéspecíficos), no permite PCR multiplex

24 REAL TIME PCR: Sondas con Fluorocromos Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET): Transferencia de energía distancia-dependiente entre dos fluorocromos adjacentes sin la emisión de un fotón. Donador y Aceptor en estrecha proximidad Espectro de excitación del Aceptor debe solapar con el espectro de emisión del Donador 1. Sondas FRET o Hybprobes: Lightcycler 2. Sondas de Hidrólisis: sondas Taqman 3. Molecular Beacons: hairpins, sunrises primers, scorpions

25 REAL TIME PCR: Sondas FRET o Hyprobes

26 REAL TIME PCR: Sondas de Hidrólisis o Taqman FAM: 6-caboxifluoresceína TET: tetracloro-6-carboxifluoresceína VIC: HEX, Texas red, etc. TAMRA:tetrametilrodamina

27 REAL TIME PCR: Sondas de Hidrólisis o Taqman FAM: 6-caboxifluoresceína TET: tetracloro-6-carboxifluoresceína VIC: HEX, Texas red, etc. TAMRA:tetrametilrodamina

28 REAL TIME PCR: Molecular Beacons

29 REAL TIME PCR: Aplicaciones (I) 1. AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN SIMULTÁNEAS Contaminaciones 2. MULTIPLEX PCR Hasta 4 target distintos Factible con sondas con Fluorocromos!!! No agentes intercalantes ß2M: ß2 microglobulin; PBGD: porphobilinogen deaminase; HPRT: hypoxanthine phosphoribosyl transferase; G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase.

30 REAL TIME PCR: Aplicaciones (II) 3. GENOTIPIFICACIÓN: CURVAS DE DISOCIACIÓN Químicas Fluorescentes no destruídas durante la PCR en tiempo real Intercalantes, molecular beacons, hyprobes No sondas Taqman! COMO SE HACE? Finalizada la PCR a. Denaturación y enfriamiento formación de complejos sonda-target b. Lectura continua de fluorescencia Determinación de Tm en los híbridos Sonda-ADN salvaje > estabilidad > Tm que Sonda-ADN mutado

31 REAL TIME PCR: Especificidad de la Señal Curvas de Disociación Generación de Amplicones No- Específicos: Parte del DNA amplificado proviene de la hibridización de los cebadores a secuencias parcialmente complementarias pero distintas a la secuencia blanco. Dímeros de Cebadores (Primers- Dimers): Anillado de cebadores a sí mismos que resulta en la generación de pequeños moldes en la amplificación por PCR (pico curva roja debajo del umbral en el control de Reactivos).

32 QUE QUIERES CUANTIFICAR? CURVA STANDARD EXTERNA (ADN o ARN) Requiere idénticas eficiencias de amplificación para stándares y muestras CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA CURVA STANDARD EXTERNA y CONTROL INTERNO (ADN o ARN) Detecta potenciales inhibidores de la reacción en cada muestra. Ej: Virología y Bacteriología CUANTIFICACIÓN RELATIVA RESPECTO A UN CONTROL ENDÓGENO (ARN) El target se mide en relación a un transcripto housekeeping que se expresa de manera constante. Ej: expresión de ARNm RESPECTO A UN GEN DE COPIA ÚNICA (ADN) El target se mide en relación a un gen celular de copia única, preferiblemente ubicado en el mismo cromosoma que el gen target. Ej: medir el número de copias de un dado gen.

33 GRACIAS POR LA ATENCION!!!!!!!