Utilidad de las técnicas de biología molecular en el manejo de bacterias fastidiosas.

Transcripción

1 Utilidad de las técnicas de biología molecular en el manejo de bacterias fastidiosas.

2 Estudio rutinario de las bacterias en el laboratorio Examen microscópico (en fresco, Gram, Ziehl- Neelsen, otros) Cultivo y aislamiento Estudio y caracterización fenotípica.

3 Bacterias fastidiosas Aquellas donde el estudio se rutina se ve dificultado: - 1) Dificultades en la observación microscópica. - 2) Dificultades en el cultivo o aislamiento: a) Lento desarrollo: períodos largos de incubación. b) Requerimientos nutricionales: medios de cultivo especiales y específicos. c) Requerimientos de atmósfera gaseosa: generación de mezclas específicas de gases, uso de jarras. d) Dificultades en la manipulación en el laboratorio: áreas de mayor bioseguridad.

4 Otras complicaciones que pueden dificultar el estudio: 1) Muestras difíciles de tomar. 2) Dificultades para el transporte (medios de transporte específicos, tiempos cortos de transporte, refrigeración). 3) Presencia de inhibidores del crecimiento. 4) Bajo inóculo bacteriano: sensibilidad disminuída. 5) Especies directamente incultivables.

5 Métodos de rutina para bacterias fastidiosas a) Mayores condiciones de equipamiento e insumos y b) Operadores más y mejor entrenados. Aún así, la sensibilidad de los mismos no siempre es buena. a) AUMENTO DE COSTOS b) RESULTADOS DE CALIDAD INFERIOR

6 Biología molecular Vs. Métodos tradicionales (en bacteriología). RELACIÓN COSTO- BENEFICIO (para biología molecular). Para bacterias comunes (no fastidiosas) es ALTA y sólo se utiliza para situaciones especiales (por ejemplo, estudios de microbiología básica o epidemiología). Para bacterias fastidiosas es OPTIMA y se puede utilizar aún en estudios sencillos como identificación.

7 Utilidad de la biología molecular en bacterias fastidiosas Toma de muestra. Tratamiento específico ( liberación y/o extracción de ácidos nucleicos). Técnicas de biología molecular IDENTIFICACION

8 Identificación bacteriana mediante técnica de PCR a) AMPLIFICACIÓN DE GENES ALTAMENTE CONSERVADOS: - 16S- r RNA - 23S- r RNA - rpob a1) -Utilización de primers o cebadores denominados universales : alta afinidad por regiones conservadas en casi todas las especies bacterianas

9 VENTAJAS - Útil en la identificación de especies desconocidas. - Útil en la búsqueda de distintas posibles especies en una misma muestra. DESVENTAJAS: -Requiere siempre posteriores ensayos de secuenciación, hibridación u otras técnicas moleculares. - Sufre frecuentemente contaminaciones que dificultan el trabajo.

10 DESVENTAJAS: -En muchos casos, no existen cebadores altamente específicos para estos genes y no se puede llegar a la identificación de especie con alta especificidad. a2) Utilización de primers o cebadores género o especie específico: unen a regiones conservadas en un género o especie y amplifican solamente en el mismo. VENTAJAS -No requieren técnicas posteriores para completar el estudio. -Buscan directamente un único blanco. -Brindan resultados rápidos.

11 Cómo podemos saber que primers usar y qué utilidad tienen cuando buscamos una especie definida? -Buscar en bibliografía publicada (técnicas de identificación molecular ya puestas a punto para esa especie). -Diseñar nuestros propios primers mediante programas útiles (ej: DNA-man). En este caso, utilizando Banco genético de datos, podemos conocer la especificidad de los mismos.

12 b) PODEMOS UTILIZAR OTROS GENES EN LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA POR PCR? Sí, de acuerdo al género o especie se eligen genes característicos, que tengan regiones altamente específicas. Ejemplos en distintas bacterias: -genes omp (proteínas de membrana externa) (Chlamydia- Rickettsia). - genes ure (enzimas ureasas)(helicobacter). - gen de enzima citrato sintetasa (Bartonella).

13 c) USO DE TÉCNICAS BASADAS EN PCR PARA MEJORAR LA IDENTIFICACIÓN. - Multiplex PCR: dos o más genes target en una misma reacción. - Nested PCR: amplificación secuencial de un gen con dos pares distintos de primers. AMBAS MEJORAN LA ESPECIFICIDAD DE LA IDENTIFICACION

14 -PCR en tiempo real (Real-time PCR): utilizando sondas marcadas altamente específicas con el producto amplificado. VENTAJAS: - Resultados muy rápidos. - Muy buena especificidad. - Posibilidad de identificar y cuantificar al mismo tiempo. - Posibilidad de medir expresión génica. DESVENTAJAS: - Costo y equipamiento.

15 OTRAS APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN BACTERIAS FASTIDIOSAS. -Detección de factores de virulencia bacterianos específicos (PCR). -Detección de resistencia antibiótica (PCR- RFLP, secuenciación etc.) -Estudios de evolución genética (MLST). -Delineación clonal para realizar estudios epidemiológicos (PFGE- RAPD- REP-PCR) (no de muestras directamente).