MICROBIOLOGIA GENERAL

Transcripción

1 MICROBIOLOGIA GENERAL TRABAJO PRACTICO Nº 2 CRECIMIENTO MICROBIANO CURVA DE CRECIMIENTO

2 Capítulos 5 y 6 Bibliografía

3 Objetivos Analizar el crecimiento bacteriano en distintas condiciones de cultivo y utilizando distintas técnicas de uso frecuente en el laboratorio de microbiología. Analizar el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica y mediante el recuento de colonias a distintos tiempos de incubación. Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva de crecimiento para cada cultivo. Curva de crecimiento diaúxica. Correlacionar temporalmente el crecimiento diaúxico con los eventos que ocurren a nivel molecular en la regulación del operón lac.

4 Temperatura Oxígeno ph Osm. Aw Presión Radiación Crecimiento microbiano Condiciones Ambientales Nutrientes -Macro y micro nutrientes -Aportados por el medio de cultivo Prod. de E Síntesis macromoléculas culas Crecimiento celular División n celular Crecimiento de la población

5 Curva de crecimiento Las cuatro fases de la curva de crecimiento Fase de crecimiento exponencial

6 Parámetros matemáticos ticos para evaluar el crecimiento microbiano Tasa de crecimiento (k): Tiempo de generación (g):

7 Ejemplo: Cultivo bacteriano que pasa de 1 x 10 3 a 1 x 10 9 en 10 horas. Calcular k y g.

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9 Medición n del crecimiento microbiano

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12 Diauxie (crecimiento diaúxico) Patrón de crecimiento microbiano bifásico que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono (por ejemplo, glucosa y lactosa). Este tipo de crecimiento microbiano es debido a la utilización secuencial de las distintas fuentes de carbono. El metabolismo del microorganismo es selectivo para uno de los sustratos: primero utiliza el sustrato que permite un crecimiento más rápido y cuando este se agota comienza a metabolizar el otro.

13 Curva de crecimiento diaúxica glucosa + lactosa: primero utiliza la glucosa y luego lactosa; notar la fase lag interna o intermedia.

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15 Jacques Lucien Monod (February 9, 1910 May 31, 1976). J. L. Monod acuñó el término francés diauxie en el año 1941 para describir el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus subtilis en un medio definido conteniendo una mezcla de distintos azúcares. Posteriormente, basándose en el modelo de crecimiento diaúxico de E. coli propuso el modelo de regulación de expresión del operón lac. Recibió el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1965 (compartido con François Jacob y Andre Lwoff).

16 Transcripción: n: the players -RNA polimerasa -Promotor -Proteínas reguladoras-- --reguladores positivos y negativos -Secuencia Shine-Dalgarno sobre el transcripto (traducción)

17 Inducción n / inhibición Aumento/reducción n de la expresión n génica g como consecuencia de un cambio en el ambiente (por ejemplo; nutrientes en el medio, temperatura, osmolaridad, fase de crecimiento). Sustrato > > expresión n de las proteínas requeridas para el metabolismo (por ejemplo, lactosa). Concentración n de un metabolito esencial (por ejemplo. Fe +3 ; aminoácidos) regula la expresión n de las proteínas necesarias para incorporarlos o sintetizarlos. Reducción o inhibición n de la expresión n cuando la concentración n es alta e inducción n cuando es baja. Expresión n de factores de virulencia inducida por contacto con el hospedador.

18 Regulación n coordinada La expresión n de varios genes puede ser controlada en forma simultánea. Operón: dos o más m s genes que se transcriben a partir del mismo promotor y cuya expresión n es controlada por las mismas proteínas reguladoras. Regulón: set de genes (y/o operónes) que se transcriben a partir de distintos promotores, pero su expresión n es controlada por las mismas proteínas reguladoras.

19 Gen, operón, regulón... Operón: lac, trp Regulón: fur

20 Ejemplo: operón lac Regulación transcripcional Genes: metabolismo lactosa Operador: sitio donde se une la proteína reguladora, en este caso el producto del gen laci; ; generalmente se superpone con el promotor impidiendo de esta manera la unión n de la ARN polimerasa.

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22 Ejemplo: operón lac

23 Elementos regulatorios Proteínas de control negativo (inhibidores): reducción n de la transcripción. n. Proteínas de control positivo (activadores): inducción n de la transcripción. n.

24 Elementos regulatorios Dos proteínas reguladoras alostéricas regulan la expresión n del operón lac: LacI alolactosa: regulador negativo CRP AMPc: regulador positivo

25 Control negativo Control Negativo: : la unión n de la proteína inhibitoria LacI asegura la inhibición n de la expresión n del operón lac cuando no hay lactosa disponible. -La unión n de LacI al operador (O) bloquea la unión n de la ARN polimerasa al promotor (P) inhibiendo la transcripción n del operón lac. -La proteína LacI (codificada por el gen laci) ) tiene 4 subunidades idénticas. La unión n a LacI al efector alostérico alolactosa (derivada de la lactosa) disminuye la afinidad de unión n de LacI al operador (O). -LacI se une al sitio O cuando no hay lactosa presente (y, por lo tanto, tampoco alolactosa). Resultado, no hay transcripción n del operón lac. -Cuando hay lactosa disponible, la alolactosa se une a LacI produciendo un cambio conformacional de la proteína regulatoria y esta ya no se une al sitio operador. Resultado, se transcribe el operón lac.

26 alolactosa galactosa-(β1-4)-glucosa galactosa-(β1-6)-glucosa La lactosa, una vez en el citoplasma bacteriano, es transformada en alolactosa por la β-galactosidasa.

27 Control positivo Control positivo: : asegura que la transcripción n del operón lac se mantenga en un nivel muy bajo (basal) cuando hay glucosa disponible. La proteína reguladora, CRP (Catabolite( Regulatory Protein; or the Catabolite Activator Protein or CAP) es un regulador global que afecta la expresión n de varios promotores. Su unión n depende de la concentración n del efector, AMPc. La concentración n de AMPc es baja cuando hay glucosa disponible (el transporte de glucosa inhibe la enzima adenilato ciclasa, PTS transport system), y alta cuando no hay glucosa. La unión n del complejo proteína CRP:AMPc facilita la unión n de la ARN polimerasa y la iniciación n de la transcripción n de varios operónes, incluido el operón lac,, que codifican para las proteínas necesarias para el metabolismo de distintos azúcares cares.

28 Sistema de fosfotransferencia dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) -El transporte de glucosa modula la concentración interna de AMPc. -El complejo CRP:AMPc activa la expresión del operón lac (y otros). -Azúcares incluídos: glucosa, fructosa, manosa, galactitol, manitol, sorbitol, xilitol y N-acetilglucosamina.

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32 El operón lac y sus elementos de control

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