TRABAJO PRÁCTICO PCR EN TIEMPO REAL VIROLOGÍA 5 AÑO BIOQUÍMICA

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1 TRABAJO PRÁCTICO PCR EN TIEMPO REAL VIROLOGÍA 5 AÑO BIOQUÍMICA En PCR convencional (ensayo de punto final), el producto amplificado se detecta una vez que la reacción ha terminado, en general, por análisis en un gel de agarosa. Por el contrario, la PCR en tiempo real (qpcr) permite que la acumulación del producto amplificado sea detectada y medida a medida que avanza la reacción. Esto es posible mediante el agregado en la reacción de una molécula fluorescente que informa un aumento en la cantidad de ADN con un aumento proporcional de la señal fluorescente. La fluorescencia medida refleja la cantidad de producto amplificado en cada ciclo. Las químicas fluorescentes empleadas para este propósito incluyen: i) colorantes de unión a ADN (agentes intercalantes) y, ii) sondas específicas de secuencias marcadas fluorescentemente (sondas de hibridación específicas). La principal ventaja de la qpcr sobre la PCR convencional es que permite determinar el número de copias del molde con precisión y alta sensibilidad en un amplio rango dinámico. Los resultados de la qpcr pueden ser: i) cualitativos: presencia o ausencia de una secuencia ii) cuantitativos: número de copias de ADN Además, los datos de qpcr se pueden evaluar sin necesidad de una electroforesis en gel, lo que reduce el tiempo de experimento y aumenta el rendimiento. Finalmente, debido a que las reacciones se ejecutan y los datos se evalúan en un sistema de tubo cerrado, se reducen las posibilidades de contaminación y se elimina la necesidad de manipulación post-amplificación. Consideremos un gráfico de amplificación de muestra (Figura 1). Figura 1. Gráfico de amplificación de muestra. En esta gráfica, el número de ciclo de PCR se muestra en el eje x, y la fluorescencia de la reacción de amplificación, que es proporcional a la cantidad de producto amplificado en el tubo, se muestra en el eje y. La gráfica muestra 2 fases, una fase exponencial seguida de una fase de meseta no exponencial. Durante la fase exponencial, la cantidad de producto de PCR se duplica en cada ciclo aproximadamente. A medida que transcurre la reacción, se consumen los componentes de la reacción y, finalmente, uno o más de los componentes se vuelven limitantes. En este punto, la reacción se retarda y entra en la fase de meseta (ciclos en la Figura 1). 1

2 Inicialmente, la fluorescencia permanece en niveles basales, y los aumentos en la fluorescencia no son detectables aunque el producto se acumula exponencialmente (ciclos 1-18 en la Figura 1). Luego que se acumule suficiente producto amplificado comienza a ser detectada la señal fluorescente. El número de ciclo en el que esto ocurre se denomina ciclo de umbral, o Cq. Dado que el valor Cq se mide en la fase exponencial cuando los reactivos no están limitados, se puede usar la qpcr para calcular de forma fiable y precisa la cantidad inicial de molde presente en la reacción. Por lo cual, si una gran cantidad de molde está presente en la muestra, se necesitarán relativamente pocos ciclos de amplificación para acumular suficiente producto para dar una señal fluorescente por encima del valor de base. Por el contrario, la cantidad de molde es poco en la muestra, se necesitarán más ciclos de amplificación para que la señal fluorescente se eleve por encima del valor de base. Dado que la cuantificación se basa en la relación entre la cantidad de molde inicial y el valor de Ct obtenido durante la amplificación, un ensayo óptimo de qpcr es esencial para una cuantificación precisa y reproducible de su muestra. Las características de un ensayo optimizado qpcr son: Curva lineal lineal (R 2 > 0.980) Alta eficiencia de amplificación (90-105%) Coherencia entre las reacciones repetidas Una de las formas para determinar si el ensayo está optimizado es generar una curva estándar por medio de diluciones en serie a partir de un control con una concentración conocida. La curva estándar se construye trazando el logaritmo de la cantidad inicial de plantilla (o el factor de dilución, para cantidades desconocidas) frente al valor CT obtenido durante la amplificación de cada dilución. La ecuación de la línea de regresión lineal, junto con el coeficiente de correlación de Pearson (r) o el coeficiente de determinación (R 2 ), se puede utilizar para evaluar si su qpcr ensayo está optimizado. Figura 2. Curvas para la cuantificación en escala no logarítmica (A) y logarítmica (B). Se muestra el Valor Umbral (Threshold) determinado por el software. 2

3 Idealmente, la serie de dilución producirá curvas de amplificación que están uniformemente espaciadas, como se muestra en la Figura 2. Dado que con cada ciclo de amplificación se duplica la cantidad obtenida, la separación de las curvas de fluorescencia se determinará mediante la ecuación: 2 n = factor de dilución donde n es el número de ciclos entre curvas en el valor umbral, es decir, la diferencia entre los valores de Ct de las curvas. Por ejemplo, con una dilución en serie de 1:10 2 n = 10 n = 3,32 Por lo tanto, los valores de Ct deben estar separados entre sí por 3,32 ciclos. La curva estándar se obtendrá graficando Ct vs log(nº copias) y realizando una regresión lineal (Figura 3). El valor R 2 cuán bien los datos experimentales ajustan con la línea de regresión. La linealidad, a su vez, da una medida de la variabilidad a través de las repeticiones de ensayo y si la eficiencia de amplificación es la misma para diferentes números de copias del molde de partida. Una diferencia significativa en los valores de Ct observados entre las repeticiones disminuirá el valor de R 2. Figura 3. Curva estándar. Se muestra el valor R 2 y la eficiencia de la reacción. La eficiencia de amplificación (E) se calcula a partir de la pendiente de la curva estándar: E = 10 - (1/pendiente) %E = (E - 1) x 100% Idealmente, la cantidad de producto de PCR aumenta de 2 veces en el número de copias con cada ciclo. Esto se traduce en una E = 2 o %E = 100% Para el ejemplo mostrado en la Figura 3: E = 10 - (1 / -3,395) = 1,97 %E = (1,97-1) x 100% = 97,0% Por lo que el número de copias aumentó 1,97 veces al final de cada ciclo, o se amplificó el 97% de la cantidad total del molde. Una E cercana al 100% es el mejor indicador de un ensayo robusto y reproducible. 3

4 Las E < 90% pueden ser causadas por un diseño deficiente de cebadores o por condiciones de reacción sub-óptimas. Las E > 105% pueden indicar un error de pipeteo en las diluciones en serie o la coamplificación de productos no específicos, como los dímeros de cebadores. 1. Singleplex o Multiplex? Las reacciones multiplex confiere las siguientes ventajas sobre las reacciones singleplex: Reducción de la cantidad de molde de partida requerido. Reducción de falsos negativos por incorporación de un control interno en cada muestra. Aumento del rendimiento de laboratorio con una reducción en los costos de los reactivos. La química seleccionada para la qpcr depende de su aplicación, si está realizando reacciones multiplex o singleplex, y consideraciones de costo. En general, para ensayos singleplex suele emplearse los intercalantes de ADN ya que estos ensayos son más fáciles de diseñar, más rápidos de configurar e inicialmente más rentables. Se puede utilizar la química de sondas en caso que se requiera aumentar la especificidad del ensayo. Para ensayos multiplex, la química basada en sondas es necesaria en donde los distintos moldes será diferenciados por sondas con diferentes fluoróforos. 2. Diseño y optimización de las reacciones con intercalante de ADN (SYBR Green I) 2.1. Diseño de cebador y producto de amplificación Una reacción de qpcr exitosa requiere una amplificación eficiente y específica del producto. Tanto los cebadores como la secuencia diana pueden afectar esta eficiencia. Para elegir teóricamente la secuencia diana y diseñar cebadores se dispone de una serie de programas de informáticos disponibles gratuitos, por ejemplo Primer3Plus 1. Recomendaciones para la elección de la secuencia diana: El producto de amplificación debe ser de pb. Los productos más cortos se amplifican con mayor eficiencia. Sin embargo, productos de < 75 pb puede no ser distinguido fácilmente de los dímeros de cebadores. Evitar la estructura secundaria si es posible. Para predecir si formará estructura secundaria a la temperatura de hibridación se puede utilizar programas informáticos como mfold 2. Evite secuencias con repeticiones largas (> 4) de bases simples. Mantener un contenido de GC de 50-60%. Recomendaciones para el diseño de cebadores: Diseñar cebadores con un contenido de GC de 50-60% Mantener una temperatura de fusión (Tm) entre 50-65ºC, calculada en condiciones de 50 mm para la concentración de sal y 300 nm para la concentración de oligonucleótidos Evitar la estructura secundaria de la secuencia diana. Evite repeticiones de Gs o Cs por más de tres bases Coloque Gs y Cs en los extremos de los cebadores Comprobar complementariedad de la secuencia de los cebadores. Verifique la especificidad utilizando herramientas informáticas como PrimerBLAST 3. 1 Primer3Plus: 2 mfold: 3 PrimerBLAST: 4

5 2.2. Validación y optimización de ensayos Las mezclas de reacción ( Master Mix) de qpcr preformuladas contienen el buffer de reacción, magnesio, ADN Polimerasa, dntps y el intercalante de ADN (SYBR Green I). Optimización de la temperatura óptima de hibridación para el ensayo La temperatura óptima de hibridación se puede evaluar fácilmente en los termocicladores de qpcr que poseen gradiente de temperatura. Estos equipos permiten probar un rango de temperaturas simultáneamente, por lo que las reacciones de optimización pueden realizarse en un solo experimento. Se recomienda probar temperaturas de hibridación por encima y por debajo del Tm calculado de los cebadores. Debido a que el SYBR Green I se une a todos los dsdna, es necesario comprobar la especificidad del ensayo qpcr analizando el (los) producto (s) de reacción. Esto es posible mediante el análisis de las curvas de la temperatura de fusión (melting curve) que se expresa en una curva cuya forma se relaciona con el contenido de GC, tamaño de los amplicones y la secuencia de los mismos. La medida de la fluorescencia dependiente de la temperatura se realiza mientras la temperatura en el termociclador aumenta de 50 C a 95 C, siendo la fluorescencia detectada dependiente de la presencia de secuencias de dsadn. Cuando las dsadn se separan por efectos de la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el intercalante deja de estar unido al producto de PCR. La mayoría de los instrumentos proporcionan un análisis de estos datos teniendo en cuenta el punto en donde aparece el primer diferencial negativo de la señal de fluorescencia con respecto a la temperatura y la temperatura de fusión (Figura 4). Este punto aparece como uno o más picos que representan las temperaturas a las que los máximos niveles de cambio de la fluorescencia se producen, correspondiendo estos a un producto particular en la qpcr. Para discriminar los productos específicos de la PCR es necesario saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los artefactos como dímeros de cebadores. Figura 4. Curvas de Temperatura de fusión (melting curve). Se observa la formación de dímeros de cebadores para el control de reactivos (curva A). Una reacción optimizada de qpcr con intercalante de ADN debería tener un único pico en la curva de fusión, correspondiente a la banda única en el gel de agarosa, como se muestra en la Figura 5. 5

6 Figura 5. Análisis de la curva de fusión y gel de agarosa del experimento de optimización de temperatura de hibridación. Evaluación del rendimiento del ensayo utilizando curvas estándar La eficiencia, reproducibilidad y rango dinámico de un ensayo de qpcr se puede determinar construyendo una curva estándar usando diluciones en serie de un molde conocido. La eficiencia del ensayo debe ser de %, el R 2 de la curva estándar debe ser > 0.980, y los valores de Ct de las repeticiones deben ser similares (DS < 0,25). Es importante observar que el intervalo de concentraciones del molde usado para la curva estándar debe abarcar todo el intervalo de concentración presente en las muestras, de forma que estén dentro del intervalo dinámico lineal del ensayo. Si las muestras dan resultados fuera del rango de las curvas estándar, se debe: Construir una curva estándar más amplia y realizar el análisis para asegurar que el ensayo sea lineal en ese nuevo intervalo. Si las muestras de ensayo dan un Ct más bajo que la mayor concentración del estándar, repetir el ensayo usando las muestras diluidas. Si las muestras de ensayo dan una Ct mayor que la concentración más baja del estándar, repetir el ensayo usando cantidades mayores de las muestras. 3. Estrategias para la cuantificación en PCR en tiempo real. Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a cabo la cuantificación de la expresión genética con q PCR. Estas estrategias son: 1. Cuantificación absoluta: relaciona la señal obtenida con la qpcr al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva de calibración. 2. Cuantificación relativa: permite obtener la magnitud de los cambios en los niveles de un molde determinado en comparación con uno o más moldes de referencia (housekeeping). Para ambas estrategias, las cantidades obtenidas de un experimento de qpcr deben normalizarse de tal manera que los datos sean biológicamente significativos. Esto se hace mediante el uso de normalizadores. En la cuantificación absoluta, los normalizadores se utilizan para ajustar o estandarizar la cantidad molde obtenida a la cantidad unitaria de la muestra. 6

7 Trabajo Práctico: Evaluación del rendimiento de un ensayo de qpcr utilizando curvas estándar. La infección por Citomegalovirus (CMV) es una de las infecciones oportunistas más comunes en individuos con algún grado de inmunosupresión (trasplantes de órganos, tratamientos prolongados con corticoides, etapas finales de la infección por HIV, extremos etarios, etc). En niños y adultos inmunocompetentes la infección cursa generalmente en forma asintomática. Está asociado a hepatitis, neumonía o a mononucleosis-like, con faringitis o adenopatías y anticuerpos heterófilos negativos. El examen para la detección de CMV por qpcr presenta alta especificidad, siendo importante no sólo en el diagnóstico diferencial en las meningoencefalitis, neumonías, infección congénita en neonatos, enfermedades gastrointestinales, sino también para diagnóstico precoz de los casos de reactivación asintomática del virus, ya que este puede ser detectado aún en ausencia de síntomas clínicos. Mezcla de trabajo para qpcr Reactivos x 1 x 17 2x qpcr Mix Plus (ROX) 10,0 µl 170,0 Mix Cebadores 10 µm 0,2 µl 3,4 H2O 4,8 µl 81,6 VF MIX 15 µl eluato 5,0 VF 20 µl - Agregar 15 µl de la mezcla de trabajo a cada pocillo de 0,1 ml. - Adicionar 5 µl de la dilución del plásmido correspondiente en el siguiente orden: A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 CMV CMV CMV CMV CMV CMV 10 6 cop/ml 10 6 cop/ml 10 5 cop/ml 10 5 cop/ml 10 5 cop/ml 10 4 cop/ml CMV 10 6 cop/ml CMV 10 4 cop/ml A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 CMV CMV CMV CMV CMV CMV CMV CMV 10 4 cop/ml 10 3 cop/ml 10 3 cop/ml 10 3 cop/ml 10 2 cop/ml 10 2 cop/ml 10 2 cop/ml NTC Perfil térmico de amplificación Etapa T (ºC) Tiempo (mm:ss) Nº ciclos Activación 95 20:00 2 Desnaturalización 95 00:15 Hibridación 60 00:35 Curva de disociación SI (70 95 ºC; rampa 0,3ºC/s) 40 7