RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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Rosa Jiménez Olivares
hace 7 años
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1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Extracción de ADN en sangre periférica La técnica de extracción por GeneClean empleada en este trabajo dio un buen rendimiento, ya que la cantidad de ADN y el nivel de purificación del mismo fueron muy buenos y las concentraciones obtenidas estuvieron entre hasta pg/μl, el cual se encontró como de buen rendimiento de la cantidad de DNA total obtenido por la técnica de GeneClean empleada en este trabajo. En la extracción del ADN proveniente de las células mononucleares no fue buena en comparación con el ADN extraído en sangre total ya que se observaron en el DNA proveniente de la capa de blancos, una calidad de banda con poca intensidad, se realizó una cuantificación del ADN extraído para ver la concentración, en donde se obtuvieron pg/μl; lo cual nos llevó a considerar que pudo ser debido a la presencia de algún componente que se encuentra en sangre que está interfiriendo, y considerar el hecho que la concentración del bacilo a nivel sanguíneo, el número de células mononucleares infectadas es bajo, como se ha reportado por otras investigaciones que se han realizado. Mientras, que en el caso del ADN proveniente de sangre total siguiendo el mismo protocolo de extracción dio un mejor resultado, la intensidad de la banda esperada fue mayor, por lo que se optó por la extracción en sangre total (ver figura 3). Sin embargo debido a este hecho y a la necesidad de tener un control positivo franco, se probó la extracción en esputo, el cual provino de uno de los pacientes positivos, y se obtuvo una excelente intensidad de banda, lo cual permitió corroborar el protocolo de extracción, y poder tener un control positivo confiable, así también permitió asegurar las condiciones de amplificación y la cepa control positivo H37Rv dio una buena intensidad de banda ver figura 4. 35

2000pb 1200pb 800pb 400pb 200pb 100pb 245pb Figura 3.- Electroforesis productos amplificación de extracción en sangre total y capa de blancos células mononucleares.

2 2000pb 1200pb 800pb 400pb 200pb 100pb 245pb Figura 3.- Electroforesis productos amplificación de extracción en sangre total y capa de blancos células mononucleares. Carril 4: marcador Low Ladder (100pb), Carril 5: ADN TB positivo muestra sangre total, Carril 6: ADN TB positivo muestra sangre periférica separación de células mononucleares. 36

2000pb 1200pb 800pb 400pb 200pb 100pb 245 pb Figura 4.- Electroforesis de los productos de PCR expectoración TB positiva y Cepa control positivo H37Rv.

3 2000pb 1200pb 800pb 400pb 200pb 100pb 245 pb Figura 4.- Electroforesis de los productos de PCR expectoración TB positiva y Cepa control positivo H37Rv. Carril 1: Marcador peso molecular Low ladder, Carril 2: ADN expectoración TB positivo, Carril 3: ADN cepa control cepa H37Rv y Carril 4: Negativo agua. 37

4 Condiciones de Amplificación Los ADN obtenidos se sometieron a los protocolos tomados de referencia donde los productos de amplificación se analizaron y el programa de amplificación con el que se obtuvieron mejores resultados fue el proporcionado por Laboratorios Clínicos de Puebla y fueron bajo estas condiciones que se partió la estandarización de la PCR. Se realizó un gradiente de temperatura para encontrar la mejor condición de alineación. De las amplificaciones por gradiente se tomaron las temperaturas recomendadas como la guía, tomando como temperatura mínima de alineación de 60 C, 62 C, 63 C, 64 C hasta 69 C para establecer la temperatura de alineación la cual fue de 67 C, ver figura 5, así mismo se probaron los tiempos de cada etapa en la amplificación y estos no variaron con respecto a la referencia. En cuanto a los números de ciclos de cada etapa de la PCR se movieron ya una vez elegido las temperaturas, y estos ciclos se modificaron de 33, 35 y 40 ciclos; pero no se obtuvieron buenos resultados, ya que al momento de correr la electroforesis para observar el patrón de bandeo, se presentaba la banda esperada de 245 pb la cual identifica la presencia del bacilo, pero se observaron bandas inespecíficas en estas reacciones, mientras que con los iniciadores del control interno no se tuvo presencia de bandas inespecíficas, con ello se realizaron distintas pruebas para descartar contaminación durante el proceso de extracción, al momento de preparar las reacciones de PCR, por contaminación del agua, ya que es común este problema, así también se descartó la posibilidad de algún problema con los iniciadores por contaminación o que estuviesen mal sintetizados. Una vez descartadas las posibles causas; se realizaron modificaciones; una fue realizar una PCR con una etapa de hot start previo, es decir, antes de colocar las muestras de ADN al termociclador se pre-calentó por 5 minutos a 93 C, ya que se ha visto que se minimiza la producción de productos inespecíficos y decrementa sensiblemente la reacción, así como se puso cuidado al momento de agregar el ADN a la 38

Figura 5.- Electroforesis productos amplificación TB positivos a gradientes en temperatura de alineación. ADN TB positivo con iniciador LCP11.

5 Figura 5.- Electroforesis productos amplificación TB positivos a gradientes en temperatura de alineación. ADN TB positivo con iniciador LCP11.- Carril 1: Muestra 60 C,Carril 2: Muestra 63 C, Carril 3: Muestra 65 C, Carril 4: Muestra 66.7 C, Carril 5: Control negativo agua 60 C. ADN TB positivo con iniciador LCP13.- Carril 7: Muestra 60 C, Carril 8: Muestra 63 C, Carril 9: Muestra 65 C, Carril 10: Muestra 66.7 C, Carril 11: Control negativo agua 60 C. 39

6 mezcla reacción de PCR, se colocaron los tubos de reacción inmediatamente a hielo para evitar cualquier reacción inespecífica como se ha visto en otros estudios. Por otro lado, se probaron distintas concentraciones de ADN purificado, se realizó PCR con distintas cantidades de iniciadores; con ello se logró eliminar las bandas inespecíficas y aparte ajustar la cantidad de muestra ADN y de iniciadores en la reacción de PCR. Las condiciones óptimas de amplificación encontradas para el diagnóstico del complejo M. tuberculosis en sangre periférica se encuentra especificada en la tabla II. Análisis de ADN amplificado Los productos de amplificación analizados provenientes de los dos pacientes con diagnóstico a TB positivo con cultivo fueron analizado por PCR, ambos DNAs fueron positivos, por el método estandarizado observándose la banda esperada de 245pb; en el caso del ADN proveniente de tres pacientes presuntamente sanos, dos de los productos amplificados dieron negativo, mientras que la tercera de las muestras extraídas dio positivo. Por lo que se realizó nuevamente la amplificación, se tomó el ADN extraído y se amplificó por duplicado dando positivo una ves más, para asegurar y corroborar que el ADN si es positivo, se mandó parte del ADN extraído por nuestra técnica y muestra de sangre de la persona al laboratorio estatal de referencia, que ya cuenta con una técnica de PCR para tuberculosis validada, obteniéndose la prueba de PCR positiva tanto en el ADN como en la muestra directa de sangre (ver figura 6). Por lo que se identificó como positivo a tuberculosis pero no se puede asegurar o hacer un diagnóstico definitivo como tuberculoso ya que para ello se tiene que dar un seguimiento médico y hacer un estudio clínico detallado, pasar por la batería de pruebas aprobadas para diagnóstico y realizar el estándar de oro, es decir el cultivo y así poder decir que es una persona con tuberculosis ya que es la única prueba de diagnóstico definitivo validada y aprobada. 40

7 Tabla II. Condiciones de amplificación por PCR. Proceso Temperatura ( C) Tiempo (minuto:segundo) Ciclos 1 Desnaturalización 95 C 10:00 minutos 1 2 Desnaturalización 94 C 0:15 segundos Hibridación o Alineación 67 C 0:20 segundos 40 Extensión 72 C 0:030 segundos 3 Extensión final 72 C 2:00 minutos 1 41

245pb 268 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 6.- Electroforesis de los productos de PCR en sangre periférica, expectoración TB positiva y negativa en gel de agarosa.

8 245pb 268 pb Figura 6.- Electroforesis de los productos de PCR en sangre periférica, expectoración TB positiva y negativa en gel de agarosa. Carril 1:Muestra sangre negativa (TB positiva),carril 2:Muestra sangre positiva, Carril 3: Muestra expectoración positiva, Carril 4: Muestra negativa, Carril 5: marcador peso molecular (100pb Low DNA Ladder) y Carriles 6,7,8: Control interno de sangre muestra negativa (TB positiva), sangre positiva, expectoración respectivamente y Carril 9: control negativo agua. 42

9 Análisis de Restricción de los productos de amplificación TB positivos El fragmento amplificado de 245 pb (muestras control positivo y sangre periférica positivo) del fragmento de inserción IS6110 se digirieron incubando con la enzima de restricción Sac II, la cual reconoce el sitio de restricción de 55pb de la secuencia. Cuando la muestra sanguínea contiene al bacilo M. tuberculosis, en la digestión del producto de 245 pb con SacII, se obtiene un fragmento de 190 pb, y si el bacilo no se encuentra presente o el ADN extraído no es de TB no hay digestión. La figura 7 muestra que en el control positivo de expectoración TB positivo si presenta una diferencia en el patrón de bandeo en donde se observó una banda de 190 pb en el producto digerido y en la no digerida se observó solamente la banda de 245 pb, en el caso de la muestra proveniente de sangre periférica se observó el mismo patrón. Esto indica que la enzima reconoció el sitio de restricción que existe solo en la secuencia del segmento de inserción IS6110 específico del complejo M tuberculosis y por tanto, se confirma que el producto purificado y amplificado en sangre periférica y en expectoración como control son efectivamente del complejo M tuberculosis. La enzima de restricción se eligió en base al análisis en un banco de genes, se realizó el mapa de restricción con diversas enzimas específicas que reconocen algún sitio específico de la secuencia utilizada y se eligió la enzima que se tubo disponible. 43

1 2 3 4 5 2000pb 1200pb 800pb 400pb 245 pb 190 pb 200pb 100pb Figura 7.- Electroforesis de productos de digestión con SacII.

10 pb 1200pb 800pb 400pb 245 pb 190 pb 200pb 100pb Figura 7.- Electroforesis de productos de digestión con SacII. Carril 1: DNA sangre periférica sin digerir, Carril 2: DNA sangre digerido, Carril 3: marcador de peso molecular Low Ladder Mass, Carril 4: DNA expectoración sin digerir y Carril 5: DNA expectoración digerido. 44

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