I SIMPOSIO Biopsia líquida

Transcripción

1 I SIMPOSIO Biopsia líquida Detección de mutaciones en biopsia líquida con tecnología CLART SANTIAGO DE COMPOSTELA, 30/01/16

2 Biopsia líquida: ADNtc Biopsia líquida comprende tres biomarcadores diferentes: ADN tumoral circulante (ADNtc),célula tumoral circulante (CTC), exosomas. Células tumorales liberan pequeños trozos de su ADN a la sangre: ADN tumoral circulando libre ADNtc: su genotipado es relativamente fácil de llevar a cabo en un corto periodo de tiempo a partir de una muestra de sangre

3 Biopsia líquida: retos tecnológicos Extracción del ADNtc: separación del plasma y extracción del ADNtc. Tipo de muestra a la que nos enfrentamos Sensibilidad y especificidad requerida Viabilidad, flexibilidad y automatización para adecuarlo al entorno clínico

4 Extracción del ADNtc 10ml sangre total 2 ml plasma Separación del plasma: Punto crítico independiente de la técnica de detección Requisitos a cumplir con capacidad de adaptarse al entorno clínico: tiempo de procesamiento, centrifugaciones, calidad del método de extracción

5 Biopsia líquida: retos tecnológicos Extracción del ADNtc: separación del plasma y extracción del ADNtc. Tipo de muestra a la que nos enfrentamos Sensibilidad y especificidad requerida Viabilidad del ensayo en un entorno clínico

6 Alto nivel de fragmentación ( pb). Hemos evaluado y determinado los fragmentos mínimos que se obtienen: Tipo de muestra 206pb óptimo para seguir con la adaptación de la tecnología CLART Hemos determinado la viabilidad de nuestra tecnología teniendo en cuenta la fragmentación del ADNtc de estas muestras ADNtc vida media corta: manipulación de las muestras

7 Tipo de muestra Concentraciones de ADNtc obtenidas: paciente tumoral versus individuos sanos Paciente tumoral: ng 0,33-10 ng/ul Individuo sano 1-4 ng/ul 0,03-0,13 ng/ul Estandarizar CLART para que se adapte a todas las muestras de ADNtc obtenidas desde ml plasma concentración mínima ADNtc cantidad ADNtc

8 Biopsia líquida: retos tecnológicos Extracción del ADNtc: separación del plasma y extracción del ADNtc. Tipo de muestra a la que nos enfrentamos Sensibilidad y especificidad requerida Viabilidad del ensayo en un entorno clínico

9 Sensibilidad y especificidad TECNOLOGÍA BIOPSIA SÓLIDA SENSIBILIDAD BIOPSIA SÓLIDA CUALIFICACIÓN TÉCNICA SENSIBILIDAD BIOPSIA LÍQUIDA TECNOLOGÍA BIOPSIA SÓLIDA PREAMPLIFICACIÓN CUALIFICACIÓN TÉCNICA qpcr 1% INTERMEDIA PCR emulsión (dilución de las moléculas de ADN en aceite: gotas) ALTA ARMS-PCR+qPCR 1% INTERMEDIA NGS ALTA Compact qpcr 1% INTERMEDIA PCR DIGITAL 1% INTERMEDIA >0,01% Por determinar ARMS-PCR Microarrays CLART INTERMEDIA ARMS-PCR Microarrays CLART 1% INTERMEDIA múltiples dianas a determinar en un mismo ensayo Flexibilidad para añadir nuevas dianas Cualificación para la realización de la técnica intermedia: fácil implantación en un hospital Sensibilidad 1% 0,01% incluyendo un paso de preamplificación

10 Tecnología CLART Biopsia sólida Biopsia sólida Extracción y Purificación del ADN Amplificación del ADN Multiplex-PCR ARMs Visualización Microarrays Mutación Resultado Controles Exón 18 Negativo Conforme G719C (c.2155 G>T) Negativo Conforme G719S (c.2155 G>A) Negativo Conforme MUESTRA G719A (c.2156 G>C) Negativo Conforme Deleción exón 19 POSITIVO Conforme Exón 20 Negativo Conforme Inserción exón 20 Negativo Conforme S768I (c.2303 G>T) Negativo Conforme Tejido incluido en parafina o fijado con formalina QiAmp DNA FFPE 2,5 h 2.5 h T790M (c.2369 C>T) Negativo Conforme Exón 21 Negativo Conforme L8561Q (c.2582 T>A) Negativo Conforme L858R (c.2573 T>G) Negativo Conforme

11 CLART CMA EGFR: biopsia líquida Detección de las principales mutaciones asociadas a cáncer de pulmón de célula no microcítica en ADN tumoral circulante 1 Obtención de plasma a partir de sangre 4 PCR multiplex específica de las mutaciones ARMS-PCR específica mutaciones en EGFR DETECCIÓN DE 40 MUTACIONES EN EGFR EXON MUTACIÓN G719A (c.2156 G>C) 2 Extracción del ADN circulante a partir del plasma 5 Visualización en arrays de baja densidad (CLART technology) EXON 18 G719C (c.2155 G>T) G719S (c.2155 G>A) Plataforma CLART Strip (CS) en forma de tira de 8 pocillos EXON 19 EXON Deleciones más prevalentes S768I (c.2303 G>T) T790M (c.2369 C>T) 5 Inserciones L858R (c.2573 T>G) 3 Preamplificación de los genes de interés Primers genéricos de los exones 18, 19, 20 y 21 de EGFR 6 Lectura automática de las mutaciones (CAR reader) EXON 21 L861Q ( c.2582 T>A)

12 Sensibilidad y especificidad CLART presenta un >95% de sensibilidad en biopsia sólida cuando hay al menos un 1% de mutación presente. CLART presenta un 62% de sensibilidad en biopsia líquida cuando hay al menos un 0,01% de mutación presente, acorde con estudios publicados sobre otros métodos similares para uso en biopsia sólida (ej. ARMS+qPCR 65,7%). PreAmp- CLART Objetivo: alcanzar la misma sensibilidad que tenemos en biopsia sólida que se traduce a una sensibilidad 0,01% en biopsia líquida (ADNtc). Objetivo: alcanzar la misma especificidad que tenemos en biopsia sólida (>98%).

13 Sensibilidad y especificidad L858R / T790M / DEL 19 Copias MUTADAS (ddpcr) Sensibilidad PreAmp-CLART Especificidad >12 100% 100% 82% de las muestras contienen >5 copias >5 93% 100% >2 88% 100%

14 Biopsia líquida: retos tecnológicos Extracción del ADNtc: separación del plasma y extracción del ADNtc. Tipo de muestra a la que nos enfrentamos Sensibilidad y especificidad requerida Viabilidad del ensayo en un entorno clínico

15 viabilidad del ensayo Adaptable a las necesidades de la clínica: Diagnóstico rápido y específico desde ml plasma Detección múltiple de varias dianas en un solo análisis Alta Sensibilidad 0,01% y especificidad 100% Laboratorio de biología Molecular Tiempo de procesamiento: Menos de 5 horas en obtener el resultado desde el ADN (múltiples dianas) Preamplificación de los genes de interés Primers genéricos de los exones 18, 19, 20 y 21 de EGFR PCR multiplex específica de las mutaciones ARMS-PCR específica mutaciones en EGFR Visualización en arrays de baja densidad (CLART technology) Plataforma CLART Strip (CS) en forma de tira de 8 pocillos Lectura automática de las mutaciones (CAR reader)

16 viabilidad del ensayo Cualificación del personal para llevarlo a cabo Técnico de laboratorio (adición de muestra, lavados similares a la técnica ELISA) Interpretación automática de resultados Equipo automático que procesa hasta 96 muestras: desde PCR Coste del ensayo 30-40% inferior al de tecnologías similares Flexibilidad para añadir nuevas dianas.

17 CLART oncología (Biopsia líquida) CLART CMA EGFR: Detección y diferenciación de 40 mutaciones puntuales, deleciones e inserciones asociadas a respuesta a terapia en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico. CLART CMA KRAS BRAF PI3K: PULMÓN COLON Detección y diferenciación de 15 mutaciones puntuales asociadas a respuesta a terapia en pacientes con cáncer de colon metastásico. CLART CMA NRAS ikras: COLON Detección y diferenciación de 10 mutaciones puntuales asociadas a respuesta a terapia en pacientes con cáncer de colon metastásico. CLART CMA BRAF MEK1 AKT1: MELANOMA Detección y diferenciación de 6 mutaciones puntuales asociadas a respuesta a terapia en pacientes con melanoma.

18 Gracias por su atención GENOMICA S.A.U. Parque Empresarial Alvento, Edificio B Vía de los Poblados 1, 1ª Madrid Tel:

19 CLART CMA EGFR: biopsia FFPE COMPARATIVA MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MUTACIONES BIOPSIA FFPE Oferta disponible Tecnología Principios de la técnica COBAS (Roche Molecular Systems, Inc.) TheraScreen QIAGEN qpcr ARMS- PCR+qPCR 1. PCR multiplex empleando sondas fluorescentes. 2. Análisis del resultado de la amplificación con el cobas z 480 analyzer. 1. PCR específica multiplex. 2. Detección del productos de PCR con las sondas Scorpions. % Mutación presente Preamplificación DNA Cualificación técnica Nº Dianas 1-5% NO Intermedia múltiples 1-5% NO Intermedia múltiples CLART CMA (GENÓMICA) ARMS-PCR microarrays 1. PCR específica multiplex. 2. Hibridación con sondas 3. Lectura automatizada (CLART technology). 1-5% NO Intermedia múltiples Número de mutaciones a determinar en un mismo ensayo: múltiples dianas que recogen la información necesaria para el oncólogo. Cualificación para la realización de la técnica intermedia: fácil implantación en un hospital Sensibilidad 1-5%: % sensibilidad validada como adecuada a la detección en biopsia FFPE % sensibilidad pendiente de validar como adecuado en biopsia líquida

20 CLART CMA EGFR: biopsia líquida COMPARATIVA MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MUTACIONES A PARTIR DE ctdna Oferta disponible Tecnología Principios de la técnica % Mutación presente Preamplificación DNA Cualificación técnica Nº Dianas BEAMING DIGITAL PCR TECHNOLOGY (SYSMEX) PCR DIGITAL 1. Pre-amplificación. 2. PCR de emulsión con bolas magnéticas. 3. Hibridación con sondas. 4. Detección de los mutantes por citometría de flujo. 0,01% SI Alta múltiples QX200 Droplet Digital PCR System (BIORAD) PCR DIGITAL 1. Generación de gotas que contienen la reacción de PCR y sondas fluorescentes (Q200 Droplet generator) 2. PCR. 3. Lectura de los resultados (Q200 droplet reader). 1-5% no intermedia Una diana NGS ion torrent,life Technologie TM Illumina TM PCR panel cancer 1.Ligación barcodes/secuencias Tag. 3. PCR en emulsión-enriquecimiento/prepcr 4. PCR de secuenciación 5. Análisis datos. 1% SI Alta múltiples therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ARMS-PCR+qPCR 1. PCR específica T790M, L858R, deleciones exón 19: 4 tubos 2. Detección del productos de PCR con las sondas Scorpions. 1-5% implica un 65.7% sensibilidad del kit NO Intermedia T790M, L858R, delecciones exón 19 CLART CMA EGFR Plasma(GENÓMICA)* ARMS-PCR microarrays 2.PCR específica T790M, L858R, deleciones exón 19: 3 tubos 3. Hibridación con sondas 4. Lectura automatizada (CLART technology). Mínimo 1% estudio sensibilidad NO Intermedia T790M, L858R, delecciones exón 19 CLART CMA EGFR plasma(genómica)* ARMS-PCR microarrays 1.Preamplificación 2.PCR específica multiplex. 3. Hibridación con sondas 4. Lectura automatizada (CLART technology). <1% SI Intermedia múltiples Sensibilidad % ó 1-5%: % sensibilidad pendiente de validar como adecuado en biopsia líquida