PERFIL MUTACIONAL EN TUMORES SOLIDOS
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- Esteban Medina Chávez
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1 PERFIL MUTACIONAL EN TUMORES SOLIDOS GLORIA RIBAS, PhD MAIDER IBARROLA, PhD INSTITUTO DE INVESTIGACION SANITARIA - INCLIVA
2 PRESENTACION DEL GRUPO INSTITUTO DE INVESTIGACION SANITARIA - INCLIVA HOSPITAL CLINICO UNIVERSITARIO DE VALENCIA COLORECTAL CANCER AND NEW THERAPEUTIC DEVELOPMENTS IN SOLID TUMORS RESEARCH GROUP UNIVERSIDAD DE VALENCIA FACULTAD DE MEDICINA EQUIPO MULTIDISCIPLINAR: INVESTIGADORES BASICOS ONCOLOGOS PATOLOGOS ENFERMERAS ADMINISTRATIVOS DATA MANAGERS
3 INTRODUCCION INCIDENCIA Y MORTALIDAD POR CANCER EN EL MUNDO (GLOBOCAN 2012 (IARC)) INCIDENCIA Y MORTALIDAD EN EL MUNDO SEGÚN LOS PRINCIPALES TIPOS TUMORALES 1. Cáncer de Pulmón 2. Cáncer de Mama 3. Cáncer Colorrectal 4. Cáncer de Próstata 5. Cáncer de Estomago 1. Cáncer de Pulmón 2. Cáncer de Hígado 3. Cáncer Estomago 4. Cáncer Colorrectal 5. Cáncer de Mama
4 INTRODUCCION INCIDENCIA (ASR) Y MORTALIDAD POR CANCER EN EUROPA Y ESPAÑA PARA AMBOS SEXOS (GLOBOCAN 2012 (IARC)) 1. Cáncer Colorrectal 2. Cáncer Próstata 3. Cáncer Pulmón 4. Cáncer Mama 5. Cáncer Vejiga INCIDENCIA (ASR) Y MORTALIDAD POR CANCER EN AMERICA DEL SUR Y PARAGUAY PARA AMBOS SEXOS (GLOBOCAN 2012 (IARC)) 1. Cáncer Mama 2. Cáncer Cérvix-Útero 3. Cáncer Próstata 4. Cáncer Pulmón 5. Cáncer Colorrectal
5 INTRODUCCION Durante la ultima decada se han producido grandes avances en el estudio molecular del cancer. Identificación de dianas biológicas mutadas o sobre-expresadas en los tejidos tumorales. Nuevo termino: Biomarcadores Dianas clave en rutas que controlan los procesos biológicos de la célula neoplásica, responsables y propias del fenotipo maligno. Determinación de los mecanismos moleculares y celulares propios de cada estadio tumoral. SECUENCIACION MASIVA La actividad de estas dianas puede modularse por inhibición o estimulación en el caso de un enzima, o mediante antagonistas o agonistas en el caso de un receptor, según lo requiera la ruta de que se trate. Gran variedad de nuevas terapias en desarrollo con aplicaciones clínicas prometedoras. Tratamiento del cáncer ha evolucionado desde los citotóxicos clásicos hasta las terapias moleculares dirigidas. Analisis de mutaciones diana en genes especificos es enormemente util en la medicina personalizada. MEDICINA PERSONALIZADA El primer paso para la elaboración de un fármaco nuevo es elegir correctamente una diana apropiada. IMPORTANCIA DE LA DETERMINACION MOLECULAR DEL TUMOR
6 INTRODUCCION Curso online de Biomarcadores en Oncologia del Instituto Roche
7 INTRODUCCION Biopsias tumorales: CARACTERIZACION MOLECULAR SE REALIZA PRINCIPALMENTE EN EL TUMOR EN PARAFINA IMPORTANCIA DE LA RECOGIDA DE DIVERSAS MUESTRAS DEL PACIENTE Y EN DISTINTOS TIEMPOS VENTAJAS - CONSERVACIÓN RUTINARIA - MATERIAL RETROSPECTIVO - ARCHIVADO EN HOSPITALES - TMAS: MENOR GASTO INCONVENIENTES - FRAGMENTADO - PEOR CALIDAD - MUESTRA ESTÁTICA EN EL TIEMPO VENTAJAS - MATERIAL RETROSPECTIVO - DINÁMICO - POCO/NO INVASIVO INCONVENIENTES - SE DEBE SOLICITAR - FRAGMENTADO (ctdna) - METODOS EN DESARROLLO o EXTRACCIÓN o DETECCIÓN
8 INTRODUCCION Limitación de las biopsias de parafina: Heterogeneidad del cáncer, tanto inter-tumoral e intra-tumoral REPRESENTACION PARCIAL DEL TUMOR Fox and Loeb, Nature 2014 SUBCLONES EN EL TUMOR - DIFERENTES SECCIONES PUEDEN TENER DIFERENTES ALTERACIONES - METASTASIS PUEDEN DIFERIR DEL TUMOR PRIMARIO - TUMOR PUEDE EVOLUCIONAR EN LA PROGRESIÓN
9 EVOLUCION DE LOS METODOS DE SECUENCIACION Maxam-Gilbert (1976) o Secuenciación Química. Modificación química del ADN y posterior escisión en bases especificas. Desventajas: técnica compleja que requiere el uso de productos químicos peligrosos y el uso de grandes cantidades de AND marcado radiactivamente a MAXAM-GILBERT Descubrimiento ADN de la doble recombinante helice de ADN 1 secuencia ADN ADN polimerasa bacteriofago
10 EVOLUCION DE LOS METODOS DE SECUENCIACION Sanger (1977) o Terminación de la Cadena. Mas eficiente y rápido. Menos reactivos tóxicos y menos cantidades de radiactividad. Clave: el uso de ddntps. Requiere de una hebra molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucleótidos marcados radiactivamente o por fluorescencia y nucleótidos que terminan la elongación de la cadena de ADN. Secuenciación por bisulfito a MAXAM-GILBERT SANGER Descubrimiento ADN de la doble recombinante helice de ADN 1 secuencia ADN ADN polimerasa bacteriofago
11 EVOLUCION DE LOS METODOS DE SECUENCIACION Secuenciación masiva o secuenciación de nueva generación (NGS): La elevada demanda de secuenciación a bajo coste ha dado lugar a las distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que son capaces de realizar en paralelo muchas operaciones de secuenciación, produciendo de miles a millones de lecturas al mismo tiempo a MAXAM-GILBERT SANGER a SECUENCIACION A GRAN ESCALA Descubrimiento ADN de la doble recombinante helice de ADN 1 secuencia ADN ADN polimerasa bacteriofago GeneBank PCR BLAST Secuencia Applied Epstein-Barr Biosystems comercializa la primera maquina de secuenciacion automatizada ABI370 Publicacion datos de secuenciacion Primera secuencia organismo de vida libre Analizador de secuencias ABI310 Fundación compañía 454 Life Sciences Phred interpretar datos secuenciacion. Secuenciacion capilar 3700 Fundación compañía Illumina PROYECTO GENOMA HUMANO
12 EVOLUCIÓN DE LOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN Secuenciadores Secuencias completas / SECUENCIACIÓN MASIVA: Illumina TECNICA POR EXCELENCIA Roche (secuenciadores 454 pirosecuenciación) JUNIOR 454 Applied Biosystems ThermoFisher Genoma completo ION S5 ION CHEF Exoma completo Paneles customizados
13 EVOLUCIÓN DE LOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN Secuenciadores Determinación de puntos calientes: Espectrometría de masas Sequenom PCR digital SENSIBILIDAD > 10% 0,122% GRACIAS AL GRAN DESARROLLO TECNOLOGICO HEMOS PODIDO ENTENDER MEJOR LA ENFERMEDAD EL DESARROLLO DE TERAPIAS DIRIGIDAS HA PERMITIDO UNA MEDICINA MAS PRECISA Y PERSONALIZADA, LO QUE PERMITIRA EL MAYOR BENEFICIO DE LOS PACIENTES
14 ORGANIZACIÓN DE UN PROGRAMA DE PRESCREENING EN CANCER: MUESTRA CRONOLOGIA ORIGEN ALMACENAJE COSTE SELECCIÓN DE LA PLATAFORMA OBJETIVO ROBUSTEZ ÉXITO EN LA SELECCIÓN DE LA TERAPIA ADECUADA A CADA PACIENTE SENSIBILIDAD
15 QUE GENES APARECEN CON MAS FRECUENCIA MUTADOS Mama PIK3CA PIK3R1 AKT1
16 TIPOS DE ALTERACIÓNES SEGÚN LA FUNCIÓN DE GENES IMPORTANTES ONCOGENES: genes con potencial de causar cáncer. En células normales están inactivados o se activan controladamente. En células tumorales están mutados en puntos calientes o hotspots o aparecen altamente sobre-expresados. AKT1, BRAF, KRAS, PIK3CA, NRAS, HRAS... BASE DE DATOS COSMIC SUPPRESORES DE TUMORES: genes cuya misión es controlar que las células alteradas no sobrevivan. Activos en las células normales, en las tumorales están inactivados mediante diversidad de alteraciones a lo largo de toda su secuencia nucleotídica. TP53, PTEN, P53, NF1, VHL... BASE DE DATOS COSMIC
17 ESPECTROMETRIA DE MASAS TECNOLOGIA SEQUENOM El análisis de mutaciones somáticas es esencial en la selección de terapias personalizadas El perfil molecular de cada paciente guiara el pronostico, la predicción y el tratamiento de la enfermedad IMPORTANCIA DE LA ESTRATIFICACION DE PACIENTES POR GENOTIPO Espectrometría de masas permite la determinación de variaciones genéticas conocidas con terapias dirigidas disponibles Es ampliamente utilizada en distintos tipos tumorales para predecir la respuesta o identificar clones resistentes Las mutaciones son detectadas según el tiempo de vuelo tras la aplicación de un laser a la matriz donde se encuentra la muestra ( matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight ) PROTOCOLO PURIFICACION ADN AMPLIFICACION PCR EXTENSION PRIMERS Parafina, tejido fresco, sangre... Cuantificación Material de partida: 20 ng Utilización de «primers» específicos amplificación Utilización «primers» extensión, hibridan después de la mutación de interés 8 horas PREPARAR PCR AMPLIFICACION SAP EXTENSION PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Eliminación de sales mediante una resina cargada positivamente Dispensar en el array ESPECTROMETRIA MALDI-TOF Determinación de cada base según el tiempo de vuelo 20 min ANALISIS DATOS Typer Viewer 1-2 horas 19 mm
18 ESPECTROMETRIA DE MASAS TECNOLOGIA SEQUENOM ANALISIS DATOS ONCOCARTA PIK3CA H1047R 19,5% CLIA PIK3CA H1047R 12,2% BRAF V600E mutación Alelo Normal Alelo Mutado ONCOCARTA PIK3CA E542K 32,0% CLIA PIK3CA E542K 32,7%
19 ESPECTROMETRIA DE MASAS TECNOLOGIA SEQUENOM VENTAJAS Puede usarse sobre cantidades muy pequeñas de ADN de parafinas Podemos testar varios genes / muestras al mismo tiempo Podemos testar hasta 40 fragmentos específicos al mismo tiempo Limite de detección de mutaciones 5% Tecnología rápida y relativamente barata. Es una técnica coste-efectiva No requiere de complejos análisis informáticos DESVENTAJAS No puede utilizarse para la detección de genes de fusión No puede utilizarse para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas No aprobada para diagnostico
20 ESPECTROMETRIA DE MASAS TECNOLOGIA SEQUENOM PANELES DISPONIBLES COMERCIALMENTE PANELES PARA TUMORES SOLIDOS: iplex HS Colon Panel: Mutaciones en los genes KRAS, NRAS, EGFR y PIK3CA con un limite de detección 1% iplex HS Lung Panel: Mutaciones en los genes BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS y PIK3CA con un limite de detección 1% PANELES ULTRASENSIBLES PARA BIOPSIAS LIQUIDAS: ULTRASEEK TM Colon Panel: A partir de 10ng de ADN detecta mutaciones al 0,1% en KRAS, NRAS, EGFR y PIK3CA ULTRASEEK TM Lung Panel: A partir de 10ng de ADN detecta mutaciones al 0,1% en BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS y PIK3CA PANELES ADDIONALES EN CANCER ONCOCARTA TM Panel: Detecta 230 mutaciones somáticas en 19 oncogenes ONCOFOCUS TM Panel: A partir de 20ng detecta mas de 300 mutaciones somáticas en EGFR, KRAS, NRAS y BRAF LUNGCARTA TM Panel: Detecta mas de 250 mutaciones somáticas en 26 genes (AKT1, ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MET, NRAS y PIK3CA) LUNGFUSION TM Panel: Detecta alteraciones en los genes ALK, RET y ROS1. COLOCARTA, GYNECARTA, LUNGCARTA Y MELACARTA Paneles POSIBILIZAR DE REALIZAR PANELES CUSTOMIZADOS Assay Design Suite/Software EpiDesigner.
21 ESPECTROMETRIA DE MASAS TECNOLOGIA SEQUENOM RESUMEN Fleitas*, Ibarrola-Villava* et al. Cancer Treat Rev 2016
22 SEQUENOM MASSARRAY TECHNOLOGY NUESTRA EXPERIENCIA OncoCarta TM PANEL v somatic mutations in 19 common oncogenes 24 multiplexes 187 assays CLIA-VALL D HEBRON CUSTOMIZED PANEL 86 mutations in 14 common oncogenes 9 multiplexes 5 additional genes (GNAS/GNAQ/IDH1/IDH2/MET) Repeated recurrent mutations and some new ones in 8 genes (AKT1/AKT2/BRAF/EGFR/KRAS/NRAS/PI3KCA/RET) ERBB2-ERBB3 - INCLIVA CUSTOMIZED PANEL 29 somatic mutations in 2 addition genes 3 multiplexes COLABORACION CON EL LABORATORIO DE EPIGENETICA Y GENOTIPADO DE LA UNIDAD CENTRAL DE INVESTIGACION MEDICA (UCIM) DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE VALENCIA (RESPONSABLE ENRIQUE BUSO) Ibarrola-Villava*, Fleitas* et al. Oncotarget 2016 Fleitas*, Ibarrola-Villava* et al. Cancer Treat Rev 2016
23 SEQUENOM MASSARRAY TECHNOLOGY NUESTRA EXPERIENCIA Hay mutaciones repetidas entre paneles que sirven como control
24 SEQUENOM MASSARRAY TECHNOLOGY NUESTRA EXPERIENCIA PACIENTES INCLUIDOS: Mas de 300 muestras han sido procesadas desde 2013 Elegibilidad: pacientes diagnosticados de cáncer avanzado y candidatos para ensayos clínicos fase I o II debido al fallo del tratamiento inicial Disponemos de toda la información clínica de los pacientes incluidos en el estudio y de los consentimientos informados Muestras de diferentes tipos tumorales: Colorrectal y mama principalmente (Proyecto SOLTI AGATA) 53 muestras dentro del proyecto nacional SOLTI
25 SEQUENOM MASSARRAY TECHNOLOGY NUESTRA EXPERIENCIA OBTENCION DEL MATERIAL GENETICO: Muestras de parafina evaluadas previamente para determinar el porcentaje tumoral (Anatomía Patológica) Contenido tumoral mínimo: 30% de células tumorales Extracción de material genético a partir de 4 secciones de 20 µm mediante los kits comerciales Recover All Total Nucleic Acid Isolation (Ambiom, Life Technologies) y el QIAamp DNA FFPE tissue kit (QIAGEN) Dilución del ADN final a 10 ng/µl Selección bloque parafina Determinación del contenido tumoral Realización de los cortes necesarios SERVICIO ANATOMIA PATOLOGICA Codificación de los pacientes Extracción de ADN Cuantificación ADN mediante nanodrop y dilución a 10 ng/µl LABORATORIO DE GENOMICA FUNCIONAL DEL CANCER
26 RESULTADOS EN LA PLATAFORMA SEQUENOM MASSARRAY NUESTRA EXPERIENCIA RESULTADOS OBTENIDOS: Resultados obtenidos utilizando el programa Sequenom MassARRAY Typer Analyser 4.0 Limite de detección establecido: frecuencia de mutación igual o superior al 10% Las mutaciones son revisadas por dos personas diferentes del laboratorio Los resultados para los genes AKT1, BRAF, EGFR, KRAS, NRAS y PIK3CA fueron validados mediante la técnica de secuenciación masiva 454 Junior (Roche) en la Unidad de Genotipado y Diagnostico Genético de la UCIM Existencia de las mismas mutaciones en dos de los paneles de Sequenom para validación de resultados La mitad de las muestras analizadas presentan al menos una mutación La concordancia entre paneles de Sequenom es del 90% La concordancia entre el panel comercial OncoCarta y los datos de NGS es del 88% La sensibilidad y la especificad que alcanzamos es 80% y 94% respectivamente
27 SEQUENOM MASSARRAY TECHNOLOGY NUESTRA EXPERIENCIA RESULTADOS OBTENIDOS: GENES MUTADOS Y MUTACIONES ESPECIFICAS ENCONTRADAS TUMORES GASTROINTESTINALES RESULTADOS DE 300 muestras: 38% tumores colorrectal 37% tumores de mama 68% tumores estadio avanzado 67% recibieron al menos una línea de tratamiento TUMORES MAMA/UTERO/ENDOMETRIO
28 RESULTADOS EN LA PLATAFORMA SEQUENOM MASSARRAY NUESTRA EXPERIENCIA RESULTADOS OBTENIDOS: GENES MUTADOS Y MUTACIONES ESPECIFICAS ENCONTRADAS COLORRECTAL MAMA OVARIO / PULMON / ENDOMETRIO / OTROS TUMORES RESULTADOS DE 197 MUESTRAS ANALIZADAS: 134 mutaciones detectadas en 97 pacientes Ruta RAS/RAF/MAPK alterada en el 51% de los tumores mutados Ruta PIK3/AKT alterada en el 36% de los tumores mutados Mutaciones en principalmente en los genes KRAS y PIK3CA Ibarrola-Villava et al., Oncotarget 2016; best poster award in WIN 2014 symposium
29 RESULTADOS EN LA PLATAFORMA SEQUENOM MASSARRAY NUESTRA EXPERIENCIA RESULTADOS OBTENIDOS: GENES MUTADOS Y MUTACIONES ESPECIFICAS ENCONTRADAS Del total, 49% de las muestras presentaban al menos una mutación (distribuidos en 16 genes): 41% KRAS 31% PIK3CA 32% de los pacientes presentaron mutaciones en dos genes (dos tercios eran pacientes de cáncer colorectal)
30 RESULTADOS EN LA PLATAFORMA SEQUENOM MASSARRAY NUESTRA EXPERIENCIA RESULTADOS OBTENIDOS: OPCIONES PARA TERAPIAS PERSONALIZADAS 101 PACIENTES FUERON CANDIDATOS PARA BENEFICIARSE DE TERAPIAS DIRIGIDAS 75 presentaban mutaciones accionables 26 pacientes de cáncer colorrectal eran WT para KRAS y podrían beneficiarse del tratamiento anti-egfr 5 pacientes recibieron terapia anti-egfr 15 pacientes recibieron OTRAS TERAPIAS 8 pacientes fueron incluidos en ensayos clínicos 5 recibieron inhibidores de PI3K/AKT 1 recibió agentes anti-igf1, 2 recibieron terapia anti-erbb3 TERAPIAS DIRIGIDAS 28% DE LOS PACIENTES RECIBIERON TERAPIAS DIRIGIDAS 34% RECIBIERON TERAPIA CONVENCIONAL 40% NO FUERON ELEGIBLES (CO-MORBILIDAD, ESTADO DE SALUD DEBIL, 2º NEOPLASIA SIMULTANEA, O PERDIDA DE SEGUIMIENTO 26% NO PROGRESARON Y NO REQUIRIERON NUEVA TERAPIA Ibarrola-Villava et al., Oncotarget 2016
31 Aproximaciones tecnológicas de próxima generación para la medicina de precisión en cáncer Modificado Friedman et al., Nat Rev Cancer, : Girotti et al., Cancer Discovery, 2016,
32 BIOPSIAS LIQUIDAS Bettegowda et al, Sci Tran Med Feb 2014
33 PLATAFORMA PCR digital BEAMing NUESTRA EXPERIENCIA Pre- Amplification Emulsion PCR Hybridization Flow Cytometry Flow cytometry analysis Wild-type signal Wild-type DNA Mutant & Wild-type DNA Mutant DNA Detection Capability (mutant DNA/ total DNA) 100% 10% 1% 0.1% Sanger Sequencing Sequenom Sanger Sequencing Pyrosequencing Real-Time PCR Mutant signal 0.01% BEAMing
34 LABORATORIO CENTRAL PARA BIOPSIAS LIQUIDAS VALENCIA SYSMEX BASADO EN CITOMETRIA DE FLUJO NRAS c13 NRAS c12 NEG 3mutand beads/0.08% POS 211 mutand beads/0.46% RED NACIONAL DE CENTROS UTILIZANDO LA PLATAFORMA SYSMEX EN HOSPITALES PRINCIPALES KIT: OncoBEAM" RAS CRC Hasta la fecha hemos estudiado 70 pacientes Hemos detectado mutaciones en KRAS/NRAS el 69% de las veces KRAS c13 POS mutand beads/15.8% POS KRAS c mutand beads/12.3%
35 LOS TRATAMIENTOS TERAPEUTICOS SE ESPECIALIZARAN SE REALIZARÁ: - UN SEGUIMIENTO DE LA CARGA TUMORAL - DE LAS RECAIDAS MOLECULARES - ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL - RELACIONARÁ VALOR PREDICTIVO DE LOS MARCADORES LOS OBJETIVOS A CONSEGUIR CON LA UTILIZACIÓN DE LA TERAPIA DIRIGIDA: - ES LA MEJORA DE LA CALIDAD DE VIDA DEL PACIENTE - DISMINUIR LA PROGRESIÓN - ALARGAR EL TIEMPO LIBRE DE ENFERMEDAD DAR EL MEJOR TRATAMIENTO PARA CADA TUMOR EVITAR EFECTOS SECUNDARIOS, Y TOXICIDADES
36 MEMBRESIA FINANCIACION
37 Vielen Dank
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