FluoroSpheres Code No. K0110

Transcripción

1 FluoroSpheres Code No. K0110 6a edición Perlas de calibración para monitoreo diario del citómetro de flujo. Contiene reactivos para 40 calibraciones. ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 1/8

2 Contenidos Página Indicaciones de uso... 2 Resumen y explicación... 2 Principio del ensayo... 2 Reactivos... 3 A. Material suministrado... 3 B. Materiales necesarios que no se suministran... 3 Almacenamiento... 3 Procedimiento de ensayo y adquisición de datos... 4 Análisis de los datos, curva de calibración... 4 A. Definiciones... 5 B. Calibración manual. Para instrumentos que expresan MFI en valores lineales C. Calibración manual. Para instrumentos que expresan MFI en números de canales Indicaciones de uso Para uso diagnóstico in vitro. FluoroSpheres está indicado para la monitorización de la eficacia del citómetro de flujo. Resumen y explicación El kit suministra perlas en blanco y perlas de calibración de un tamaño de 3,2 µm. Las perlas de calibración son una mezcla de 5 poblaciones de perlas que tienen diferente intensidad de fluorescencia, y una población de perlas no fluorescentes. En las perlas fluorescentes hay atrapada una combinación de fluorocromos únicos que permiten la exitación lumínica de una longitud de onda entre 365 a 650 nm. Debido a que los fluorocromos de las perlas son diferentes de los fluorocromos que se utilizan habitualmente en la citometría de flujo, las propiedades espectrales son diferentes. Por lo tanto, las perlas no se pueden utilizar para establecer una compensación de la fluorescencia. Debido a que contiene moléculas asignadas de valores de fluorocromo equivalentes (MEF) para las poblaciones de perlas fluorescentes, el uso de FluoroSpheres permite la transformación de unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia media (MFI) en unidades absolutas para asegurar la calidad y para informar los datos de la citometría de flujo. Principio del ensayo 1. En primer lugar se analizan las perlas en blanco para establecer la calibración óptima de los instrumentos para todos los canales de interés. 2. En segundo lugar, se analizan las perlas de calibración. Los datos se utilizan para la construcción de la curva de calibración, en la que se confrontan los valores de MFI con los de MEF. La curva de calibración y los parámetros estadísticos asociados se utilizan para evaluar la linealidad del instrumento. Además, también se pueden determinar el umbral de detección y el rango dinámico del instrumento para la curva de calibración. ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 2/8

3 La calibración con FluoroSpheres se puede realizar de dos maneras: Calibración constante del instrumento. Cuando se utiliza este método todos los parámetros del instrumento permanecen sin cambios a lo largo del tiempo. Se monitorea el MFI para los diferentes picos y se muestran los resultados como fecha de calibración versus MFI. Respuesta constante del instrumento. Mediante este método se ajusta el voltaje de PMT de manera que el MFI de uno de los picos fluorescentes altos aparece siempre exactamente en el mismo canal. Luego se muestran los resultados como fecha de calibración versus voltaje de PMT. Reactivos A. Material suministrado Vial 1 1,7 ml En azida sódica al 0,02%, NP40 al 0,01%. Vial 2 1,7 ml Contiene perlas en blanco y 5 poblaciones de perlas con diferentes cantidades de fluorocromos expresados en valores MEF para FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 y APC, respectivamente. Para valores MEF específicos para cada lote, por favor consulte la hoja de valores analíticos que se adjunta. En azida sódica al 0,02%, NP40 al 0,01%. B. Materiales necesarios que no se suministran Equipamiento de laboratorio general para procedimientos de citometría de flujo. Papel gráfico semilogarítmico y doble logarítmico de 5 ciclos. Calculadora. Programas de software para análisis de los datos de la citometría de flujo. Programas con hojas de cálculo como Microsoft Excel. Estos programas son opcionales. Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Este producto contiene azida sódica (NaN 3 ), un compuesto altamente tóxico en su forma pura. A las concentraciones en que está presente en el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la azida sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando acumulaciones de azidas metálicas altamente explosivas. Tras desechar el producto, abra el grifo y deje que salga abundante agua para despejar las cañerías de cualquier acumulación de azidas. Almacenamiento Almacene el kit a una temperatura de 2 a 8 C. No lo utilice después de la fecha de caducidad impresa en el vial. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones distintas de las especificadas, éstas deben ser verificadas por el usuario. Si observa resultados inesperados que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con el kit, contacte con nuestro servicio de asistencia técnica. ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 3/8

4 Procedimiento de ensayo y adquisición de datos 1. Mezcle vigorosamente las perlas con un vórtex o mediante agitación. 2. Adicione 0,5 ml de un tampón de dilución adecuado, por ejemplo solución salina tamponada con fosfatos, ph 7,2, para cada uno de los dos tubos de ensayo. Adicione una gota del vial 1, perlas en blanco, al primer tubo de ensayo y una gota del vial 2, perlas de calibración, al segundo tubo. Mezcle utilizando un vórtex a fin de garantizar que las perlas estén en suspensión. 3. Antes de la adquisición de datos, se selecciona la amplificación logarítmica de los detectores de fluorescencia de interés, y se calibran a cero la compensación de fluorescencia para todos los parámetros. 4. Coloque el tubo con las perlas en blanco en el citómetro de flujo. 5. Ajuste los voltajes PMT para permitir que el pico de las perlas en blanco aparezcan en la primera década del histograma. 6. Mediante el uso de dispersión frontal versus dispersión lateral, establezca una sincronización viva en los singlets de perlas (véase Figura 1). 7. Adquiera un mínimo de eventos sincronizados en las perlas en blanco. 8. Coloque el tubo con las perlas de calibración en el citómetro de flujo y adquiera los datos de un mínimo de eventos sincronizados. 9. Se deberían visualizar seis picos de intensidad de fluorescencia diferentes en el canal de fluorescencia de interés (véase Figura 2). Análisis de los datos, curva de calibración El análisis de los resultados está confinado a los singlets de perlas sincronizadas libres de residuos, como se define en el diagrama de puntos de dispersión frontal versus dispersión lateral (véase Figura 1). Los marcadores o regiones individuales se utilizan para definir cada una de las 6 poblaciones de perlas de las perlas de calibración (véase Figura 2). Las regiones se utilizan para determinar el MFI de cada población de perlas. Figura 1. Dispersión frontal versus dispersión lateral en las perlas en blanco. Se calibró la sincronización para recoger los singlets de perlas. ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 4/8

5 855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts FL1-H Figura 2. Histograma de poblaciones de perlas FluoroSpheres. A. Definiciones Compensación logarítmica La compensación logarítmica representa el valor de fluorescencia del canal 0. Habitualmente el canal 0 se representa en el software del fabricante mediante valores arbitrarios, por ejemplo, 1 para la mayor parte del software Becton Dickinson, y 0,1 para la mayor parte del software Coulter. AvgRes% El porcentaje residual promedio (AvgRes%) es una medida no ponderada de la linealidad de respuesta del instrumento. Se lo calcula mediante la determinación del porcentaje absoluto promedio de variación de la línea de regresión a partir de los puntos reales. r 2 El coeficiente de determinación (r 2 ) es una medida ponderada de linealidad. Es de mucha utilidad cuando se analizan datos logarítmicos. Umbral de detección Aunque las perlas en blanco no contienen fluorocromos atrapados, pueden dar lugar a una señal. Esta señal representa el ruido de fondo y, por lo tanto, el nivel de detección del instrumento. MEF Las moléculas de fluorocromo equivalente son la cantidad de fluorocromo por perla. Década logarítmica La década logarítmica es el rango de escala completa calibrada, o rango dinámico, del parámetro de fluorescencia que se está calibrando. Por lo general, los citómetros de flujo se suministran con amplificadores que tienen un rango dinámico de 3,5 o 4 décadas logarítmicas, lo que depende del fabricante. La disminución de la eficacia del citómetro de flujo afectará la década logarítmica. B. Calibración manual. Para instrumentos que expresan MFI en valores lineales. Construcción de la curva de calibración: ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 5/8

6 1. Determine el MFI de cada una de las 6 poblaciones de las perlas de calibración FluoroSpheres. 2. Construya un diagrama de puntos de MFI contra el logaritmo de MEF correspondiente de los diferentes picos. Calcule la línea recta "que mejor se adecue" de acuerdo a la siguiente fórmula: logaritmo de (MEF) = a x logaritmo de (MFI) + b en la que a es la pendiente y b es la intercepción en el eje de las y, también denominado compensación logarítmica o valor de canal cero. 3. Calcule los parámetros estadísticos asociados AvgRes% y r 2 de la curva de calibración. 4. El rango dinámico del amplificador se expresa en décadas logarítmicas. Las décadas logarítmicas se pueden calcular a partir de la línea de regresión mediante la resta del logaritmo de (MEF min ) del logaritmo de (MEF max ). El logaritmo de (MEF min ) y el logaritmo de (MEF max ) derivan del valor MFI más bajo y del valor MFI más alto, respectivamente. En este caso, el MFI de MEF min y de MEF max es 10 0 y 10 4, respectivamente. (escala logarít mica) Umbral de detección (MEF de perla 1) (en blanco) compensación logarítmica (valor del canal cero) Figura 3. Curva de calibración (línea de regresión) basada en las FluoroSpheres. Ejemplo de cálculo: décadas logarítmicas = logaritmo de (MEF max ) logaritmo de (MEF min ) décadas logarítmicas = logaritmo de (188735) logaritmo de (30,8) décadas logarítmicas = 5,28 1,49 décadas logarítmicas = 3,79 Canales por década: Debido a que el número de canales es 1.024, el número de canales por década es: 1024/3,79 = 270 C. Calibración manual. Para instrumentos que expresan MFI en números de canales. Construcción de la curva de calibración: 1. Determine el MFI de cada una de las 6 poblaciones de las perlas de calibración FluoroSpheres. 2. Realice un diagrama de MFI contra el logaritmo de (MEF) y calcule la línea recta que mejor se adecue de acuerdo a la siguiente fórmula: logaritmo de (MEF) = a x MFI + b (valores lineales) en la que a es la pendiente y b es la intercepción en el eje de las y. ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 6/8

7 3. Calcule los parámetros estadísticos asociados AvgRes% y r 2 de la curva de calibración. 4. El rango dinámico del amplificador se expresa en décadas logarítmicas. Las décadas logarítmicas se pueden calcular a partir de la línea de regresión mediante la resta del logaritmo de (MEF min ) del logaritmo de (MEF max ). El logaritmo de (MEF min ) y el logaritmo de (MEF max ) derivan del valor MFI más bajo y del valor MFI más alto, respectivamente. En este caso, el MFI de MEF min y de MEF max es 0 y 1023, respectivamente. Umbral de detección (escala logarít mica) (MEF de perla 1) (en blanco) compensación logarítmica (valor del canal cero) (número de canal) Figura 4. Curva de calibración (línea de regresión) basada en las FluoroSpheres. Ejemplo de cálculo: décadas logarítmicas = logaritmo de (MEF max ) logaritmo de (MEF min ) décadas logarítmicas = logaritmo de (188735) logaritmo de (30,8) décadas logarítmicas = 5,28 1,49 décadas logarítmicas = 3,79 Canales por década: Debido a que el número de canales es 1.024, el número de canales por década es: 1024/3,79 = 270 ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 7/8

8 Explicación de los símbolos Número de catálogo Límite de temperatura Fecha de caducidad Producto sanitario para diagnóstico in vitro Consulte las instrucciones de uso Contenido suficiente para <n> ensayos Código de lote Fabricante Producido por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tel Fax ( ) SSK0110CE_02/ES/ p. 8/8