CITOMETRÍA A DE FLUJO

Transcripción

1 CITOMETRÍA A DE FLUJO Estudio de suspensiones celulares u otras partículas biológicas Analiza en forma rápida y eficiente, células individuales que fluyen a gran velocidad en un medio líquido y atraviesan una luz monocromática láser Cada célula es evaluada según diversas características: forma, tamaño, complejidad citoplasmática, composición antigénica y bioquímica

2 Cómo funciona un citómetro? Sistema de flujo Dispersión de la luz Detector de fluorescencia Separación y detección de la luz Amplificación de la señal obtenida Corrección de errores: solapamiento espectral Digitalización y almacenamiento de la información Análisis de datos mediante el empleo de un software apropiado

3 Citómetro de flujo

4 Sistema de flujo f de células Muestra Flujo de líquido Rayo láser

5 Detector de luz naranja Detector de luz verde Filtro óptico 55nm Componentes de un citómetro de flujo Filtro óptico 580nm Espejo dicroico Muestra Detector de luz roja Detector de luz dispersada a 90º Filtro óptico 670nm Dispersador del rayo Detector de luz incidente frontal Fuente de rayo láser

6 Dispersión frontal de la luz Láser Dispersión de la luz en forma frontal: Forward scatter (FSC) Tamaño celular Linfocitos < Monocitos < Polimorfonucleares

7 Dispersión de la luz a 90ºC Láser Dispersión de la luz a 90º : Side scatter (SSC) Complejidad citoplasmática y gránulos Linfocitos < Monocitos < Polimorfonucleares

8 Detectores de Fluorescencia Láser Detectores de fluorescencia: Verde (FL),, naranja (FL) y rojo (FL) Ags expresados en la superficie celular o intracelulares: fenotipo y funcionalidad

9 DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA Fluorocromos TC PerCP QR Cy5 APC Detectores FL- FL- FL- FL-4

10 DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN N FSC SSC FL- FL- FL- FL-4 TIEMPO Los pulsos de Voltaje detectados (señales analógicas) son transformadas en señales digitales y almacenadas en un soporte informático

11 Representación monoparamétrica de datos Histogramas: Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número n de células c (eventos) que emiten esa intensidad Nº de eventos M Intensidad de Fluorescencia

12 Histogramas FL- Fluorescencia verde SSC Granularidad FL- Fluorescencia naranja FSC Tamaño FL- Fluorescencia roja

13 Representación biparamétrica en D Diagrama de puntos / dot plot Representación simultánea de dos parámetros X e Y X representa el valor de la señal de un parámetro metro FL- Y representa el valor de la señal del otro FL-

14 Diagrama de dot plot density

15 Representación n D Countour plot / Diagramas de contornos X, Y más m s una tercera dimensión n Una superficie tridimensional La altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros

16 Selección n de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows( windows) M M Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés

17 Gates biparamétricos tricos Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros Se emplean para estudiar las características de subpoblaciones celulares R4 R R R

18 Análisis de una población n de sangre periférica rica obtenida por buffer de lisis Granulocitos Monocitos SSC= GRANULARIDAD Linfocitos T y B FSC-Height -> 4C54400 FSS= TAMAÑO

19 Nº de eventos Células de sangre perifér érica: Anti CD FITC, anti CD4 PE y anti CD8 PerCP Li T Intensidad de fluorescencia verde Anti CD FITC Simple positivo: CD4+CD-: Mn PE-CD4 Doble negativo: CD4-CD-: LiB, CD y Ma PE-CD Simple positivo: CD PerCP-CD8 0 0 FITC-CD Simple positivo: CD8+ Doble positivo: CD4+CD+: LiT CD4+ Simple positivo: CD4-CD+: LiT CD8+

20 Microscopía vs Citometría de Flujo Muestra fijada Cualitativo o semicuantitativo Sensibilidad depende del operador Reproductibidad media Patrones estructurales definidos Distribución espacial Nº limitado de células Células en suspensión Cuantitativo Alta sensibilidad y reproductibilidad Medida multiparamétrica en grandes nº de células individuales Patrones estructurales cualitativos No informa distribución espacial

21 Trabajo Prác áctico Nº 4: 4 Estudio de las célc élulas del sistema inmune - Obtención de células: Rata de bioterio normal Bazo, Timo, Nódulo linfáticos y células de peritoneo - Aislamiento de células: BAZO Sacrificio del animal Extracción de órganos Disgregación de los órganos en malla metálica Buffer de lisis: Lisis de GR Buffer Hipotónico Suspensión celular Pellet de Células Suspensión de CMN y PMN

22 Gradiente de densidad: Ficoll-Hypaque Aislamiento de CMN Suspensión de CMN -Ensayo de viabilidad: exclusión de azul de tripán: determinar el % de células viables 4-Caracterización Morfológica