ÍNDICE 1. Resumen 2. Introducción 3. Revisión Bibliográfica

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1 ÍNDICE Resumen. Introducción.. Revisión Bibliográfica Generalidades del Sistema Inmune Órganos del Sistema Inmune Células del Sistema Inmune Neutrófilos Monocitos y Macrófagos Eosinófilos, Basófilos y Mastocitos Linfocitos Linfocitos T Linfocitos B Natural Killer. 3.2 Respuesta Inmune Respuesta Inmune Antiviral Respuesta Inmune Antibacteriana Respuesta Inmune Antiparasitaria Inmunidad Innata Fagocitosis Mecanismos efectores intracelulares de células fagocíticas 3.4 Inmunidad adaptativa Reconocimiento de Antígenos a través de Anticuerpos Reconocimiento de Antígenos por Linfocitos T Selección Clonal y Memoria Inmune Frutas y Hortalizas en Chile Alimentos Funcionales Inmunomodulación Clasificación de los Inmunomoduladores iii

2 Mecanismos de la Inmunomodulación Ensayos de Inmunomodulación Medios de Cultivo Celular Efecto en formación de Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) Efecto en formación de ROS por reducción del Nitroazul de tetrazolio (NBT) Ensayo de proliferación Ensayo de reducción del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) 3.8 Peritoneo: Función y composición celular.... Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos.... Materiales y Métodos Preparación de Extractos Obtención de la muestra 5.3 Estudio de Fagocitosis in vitro Preparación de la muestra Lectura de la muestra Cultivo celular para ensayos de proliferación y fagocitosis in vitro Obtención de células mononucleares Viabilidad celular Estandarización del cultivo celular Ensayo de proliferación celular in vitro Obtención de células mononucleares Estandarización de extracción de Macrófagos Peritoneales Estandarización de extracción de Esplenocitos Análisis Estadístico... Resultados Estudio de Fagocitosis in vitro Cultivo de Mononucleares Procesamiento de la muestra para cultivo de Mononucleares iv

3 Viabilidad Celular Estandarización de ensayo de proliferación celular. 6.4 Efecto en formación de ROS Recuento de Leucocitos utilizado en la extracción de Macrófagos Peritoneales Estandarización para la obtención de esplenocitos... Discusión 7.1 Estudios de Fagocitosis in vitro 7.2 Cultivo de Mononucleares 7.3 Ensayo de proliferación basada en la reducción del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) 7.4 Efecto en formación de ROS mediante la reducción del Nitroazul de tetrazolio (NBT) Obtención de Macrófagos Peritoneales. 7.6 Obtención de Esplenocitos Conclusión.. Bibliografía.... Anexos v

4 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13 Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Reacción de NBT con iones superóxidos Estructura química de MTT y su producto de formazan reducido... Regulación de una inflamación peritoneal aguda... Extracción de muestra sanguínea... Orden de carga de los pocillos previo a la incubación.. Modelo murino utilizado en ensayo... Ratón sacrificado, fijado por sus extremidades a una zona delimitada... Procedimiento del ensayo de fagocitosis... Polimorfonuclear visualizado mediante microscopio óptico con lente de inmersión.. Gráfico de fagocitosis porcentual de extractos de frutas y hortalizas Gráfico de índice fagocítico de extractos de frutas y hortalizas Procedimiento para obtención de células mononucleares.. Tubos Falcon con suspensión de mononucleares Ensayo de viabilidad celular mediante método de exclusión con azul tripán... Observación de poblaciones celulares por microscopio invertido. Formación de cristales de MTT Formazan Gráfico de porcentaje de proliferación celular según extractos de frutas y hortalizas... Gráfico de porcentaje de proliferación en base a una curva de concentración de extractos de frutas y hortalizas.. Visualización de cristales de NBT reducido.. Gráfico de porcentaje de reducción de NBT según extractos de frutas y hortalizas... Gráfico de porcentaje de reducción de NBT en base a una curva de Pág vi

5 Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28. concentración de extractos de frutas y hortalizas.. Procedimiento para obtención de macrófagos esplénicos.. Diferencia entre una muestra tratada con buffer de lisis y sin buffer. Espectro HPLC realizado a un extracto total de frutilla. Espectro HPLC obtenido de un estándar de ácido cafeico (50 ppm).. Espectro HPLC obtenido de un estándar de ácido ferúlico (50 ppm). Espectro HPLC obtenido de un estándar de ácido p-cumárico (50 ppm)... Espectro HPLC obtenido de un estándar de àcido clorogénico (50 ppm) vii

6 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Receptores tipo Toll y sus ligandos endógenos y microbianos.. Distintos tipos de medios para cultivo celular, ejemplos y sus respectivos usos.. Extractos metanólicos y acuosos de frutas y hortalizas utilizadas en el estudio Especificación de variables utilizadas por distintos autores para la obtención de macrófagos peritoneales... Recuento celular y determinación de hemoglobina en ratones, según tipo, volumen y concentración de reactivo inoculado y tiempo de tratamiento.. Recuento celular y determinación de hemoglobina en muestra con y sin buffer de lisis Amonio-Cloruro-Potasio. Pág viii