INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA

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1 INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA Objetivos Al finalizar el trabajo práctico los estudiantes estarán en capacidad de: - Conocer el principio que rige la espectrofotometría. - Interpretar el basamento químico de la Ley de Beer-Lambert. - Aplicar los principios de la espectrofotometría en la construcción de la curva de calibración y el espectro de absorción de un compuesto. Introducción Las ondas de radiación electromagnética se componen de crestas y valles, convencionalmente representadas las primeras hacia arriba y las segundas hacia abajo. La distancia entre dos crestas o valles se denomina longitud de onda (ë). La frecuencia de la onda esta determinada por las veces que ella corta la línea base en la unidad de tiempo (casi siempre medida en segundos), esta frecuencia es tan importante que las propiedades de la radiación dependen de ella y está dada en Hertz. La amplitud de onda esta definida por la distancia que separa el pico de la cresta o valle de la línea de base, la energía que transporta la onda es proporcional al cuadrado de la amplitud. La unidad de medida para expresar estas distancias tan pequeñas entre las crestas es el nanómetro (Figura 1). Figura 1. Las ondas de radiación electromagnética 1

2 Los diferentes tipos de radiación electromagnética forman en conjunto, el espectro electromagnético. Estas radiaciones presentan diferentes longitudes de onda que van desde las de menor longitud de onda, como son los rayos cósmicos, los rayos gamma ( nm)) y los rayos X ( nm), pasando por la luz ultravioleta ( nm), la luz visible (desde el rojo 350 nm hasta el violeta 780 nm) y los rayos infrarrojos( nm), hasta las ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda, como son las microondas y las ondas de radio cuyas longitudes de onda están por encima de 10 5 nm. Figura 2. El espectro electromagnético El principio que rige la espectrofotometría se basa en el empleo de las interacciones entre la radiación electromagnética y la materia. La espectrofotometría es uno de los métodos analíticos de mayor importancia y utilidad en bioquímica ya que permite medir la cantidad relativa de luz absorbida o transmitida por la materia (ej. moléculas biológicas en disolución acuosa: proteínas, aminoácidos, metabolitos, etc.) medida como absorbancia (Abs) o transmitancia (%T), respectivamente. 2

3 Prácticas de Bioquímica II La absorbancia es la medida de la cantidad de luz bloqueada o absorbida por una solución. Las moléculas que absorben luz se llaman cromóforos. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos, aquellas longitudes de onda no absorbida. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente, absorbe longitudes de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones visibles, ultravioleta e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. La transmitancia es el parámetro inverso de la absorbancia, constituye la medida porcentual de la cantidad de radiación o luz que pasa a través de la solución. De este modo, una solución no coloreada no absorbente, mostrará 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado, y 0,00 de absorbancia (Figura 3). A= - Log (% T/100) Luz incidente Luz emergente no absorbida T = 100 (Antilog A) Figura 3. Relación entre absorbancia y transmitancia. Para medir la absorbancia y/o transmitancia de un compuesto en solución se utiliza el espectrofotómetro, instrumento que permite determinar la radiación absorbida o transmitida por una solución, a una determinada longitud de onda. 3

4 Los componentes básicos de cualquier espectrofotómetro son: 1.-Fuente de luz o radiación la cuál tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que abarca (usualmente es una lámpara de tungsteno para luz visible, y una de deuterio para luz ultravioleta); 2. Monocromador que selecciona la longitud de onda deseada del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra; 3.-Compartimiento para la muestra y 4.-Fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra (Figura 4). Figura 4. Componentes de un espectrofotómetro Los avances tecnológicos de los últimos años han permitido mejorar la precisión y versatilidad de los espectrofotómetros, por lo tanto hay diversos modelos disponibles en el mercado, según la utilidad que se le va a dar. Ley de Beer- Lambert. La fracción de luz incidente que es absorbida por una solución depende de la longitud de onda, de la concentración del compuesto absorbente en solución y de su naturaleza química. La relación matemática entre estas variables fue establecida por Beer- Lambert y se expresa con la siguiente ecuación: 4

5 A = åcl Donde: A = Absorbancia o densidad óptica å = Coeficiente de absortividad molar (constante) c = Concentración de la muestra l = Longitud de onda Si se mantiene constante l, tenemos que A es directamente proporcional a la concentración de la muestra. De este modo, la ley de Beer- Lambert establece que la concentración de un analito en solución, es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida. Cuando se desconoce la concentración de un analito, ésta puede ser determinada a partir de una curva de calibración que se construye graficando los valores de absorbancia contra distintas concentraciones de un estándar o patrón. La interpolación de la absorbancia de la muestra desconocida en la curva de calibración nos permitirá conocer la concentración del analito. Cuando el método de determinación del analito cumple la ley de Beer- Lambert, la curva resulta una función lineal, por lo que se puede calcular la concentración del analito aplicando la siguiente ecuación: C A = A A x C E A E Donde: C A = Concentración del analito A A = Absorbancia del analito C E = Concentración del estándar A E = Absorbancia del estándar 5

6 Espectro de absorción Es la representación gráfica de la cantidad de luz absorbida por un compuesto a diferentes longitudes de onda. El espectro de absorción es característico de cada compuesto y provee información relevante sobre la estructura de la molécula, lo que permite la identificación de compuestos (Figura 5). Azul de metileno A A b s o r b a n c i a λ Longitud de onda (nm) λ Max 660 nm En general un compuesto puede absorber en la región VIS si contiene al menos 5 grupos cromoforos conjugados y grupos auxocrómicos. Figura 5. Espectro de absorción del azul de metileno. Ventajas y aplicaciones de la espectrofotometría Este método analítico presenta varias ventajas sobre otros métodos de laboratorio, tales como: rapidez, precisión, versatilidad, fácil aplicación y eficiencia en costo. La espectrofotometría tiene diversas aplicaciones, entre las que se pueden mencionar: - Análisis cuantitativo de compuestos (orgánicos o inorgánicos) -Identificación de compuestos según su espectro de absorción 6

7 PARTE EXPERIMENTAL Materiales y equipos. Azul de metileno Balones aforados de 100 ml Pipetas graduadas de 10 ml Cilindro graduado de 100 ml Espectrofotómetro modelo Spectronic 20. Tubos para Spectronic 20 Pizetas Gradillas Agua destilada Regla Papel milimetrado PROCEDIMIENTO Experimento 1. Aplicación y demostración de la Ley de Beer-lambert. Utilizando la solución madre de azul de metileno (0,2 mg %) suministrado por el docente, prepare en un balón aforado de 100 ml, las siguientes diluciones: Balón Concentración (mg %) 0,04 0,08 0,16 ml solución madre Completar con agua destilada hasta la señal de aforo -Agitar todos los balones hasta que el color sea homogéneo. -Ajustar el espectrofotómetro a cero (0,0) absorbancia (100% T) con agua destilada (blanco) a 660 nm.de longitud de onda. 7

8 -Utilizando un tubo para espectrofotómetro, lea la absorbancia de la solución contenida en cada balón y registre los valores de absorbancia en la siguiente tabla: Balón Concentración (mg %) 0,04 0,08 0,16 0,2 Absorbancia Construya la curva de calibración graficando la absorbancia (ordenadas) contra la concentración de azul de metileno (abscisas). Utilice papel milimetrado. Experimento 2. Espectro de absorción. 1. Ajustar la primera longitud de onda a medir (340 nm) y calibrar a cero el espectrofotómetro utilizando un blanco de agua destilada 2. Agregar la solución de azul de metileno (0,2 mg%) en otro tubo para espectronic 20 y registre el primer valor de absorbancia. 3. Registre la absorbancia a distintas longitudes de onda (según tabla anexa). 4. Anote los valores de absorbancia de la solucion de azul de metileno 0,2 mg % para cada longitud de onda, obtenidos por el docente. ë Absorbancia 5. Construya el espectro de absorción del azul de metileno, utilizando los valores de absorbancia y longitudes de onda suministrados por el profesor. Utilice papel milimetrado. 8

9 AUTOEVALUACIÓN 1. Cómo será la absorción de radiación electromagnética de una solución que contiene uno o más compuestos absorbentes. 2. Establezca las diferencias entre el tubo blanco y estándar. 3. Cual es la relación entre absorbancia y transmitancia? 4. Como influyen los diferentes parámetros instrumentales (grosor de la celda y longitud de onda) en la determinación de la absorbancia? 5. Explique ampliamente la Ley de Beer Lambert y cada uno de sus términos. 6. Calcule la absorbancia de una solución que presenta un %T igual a 56. BIBLIOGRAFÍA FISCHER & PETERS., Compendio de análisis químico cuantitativo; Nueva Editorial Interamericana, S. A. de C. V.; 1ª edición; 1971; pp GILBERT H. AYRES., Análisis químico cuantitativo; Ediciones del Castillo, S. A.; 1970; pp GONZALEZ DE BUITRIAGO, J. M y col., Problemas de Bioquímica. Primera edición. editorial ALHAMBRA pp MCKEE, J.; MCKEE, T., Bioquímica, la base molecular de la vida. Tercera edición. Editorial McGraw Hill Interamericana. España pp SKOOG, DOUGLAS A., y COL. Química analítica. McGraw Hill. México pp