QPCR aplicada al estudio de la expresión de genes relacionados con la calidad del aceite de oliva

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Francisca Márquez Morales
hace 5 años
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1 QPCR aplicada al estudio de la expresión de genes relacionados con la calidad del aceite de oliva Dra. Luisa Hernández Instituto de la Grasa (CSIC), Sevilla

Manuel Martínez Rivas David Velázquez Palmero Becaria FPI Lourdes García Vico

2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de Productos Vegetales Grupo de Genómica, Biología Molecular y Bioquímica de lípidos de plantas IP - José Manuel Martínez Rivas David Velázquez Palmero Becaria FPI Lourdes García Vico Titulado Superior Mª Dolores Sicardo Jiménez JAE-Doc Mª Luisa Hernández Jiménez

ÁNALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL (Real-Time QPCR) La PCR cuantitativa en tiempo real (Real-time QPCR) es una técnica ampliamente utilizada para la

3 ÁNALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL (Real-Time QPCR) La PCR cuantitativa en tiempo real (Real-time QPCR) es una técnica ampliamente utilizada para la cuantificación de DNA. En la Real-time QPCR se utiliza una molécula fluorescente para monitorizar el progreso de la reacción de amplificación. En cada ciclo de amplificación, la intensidad de la fluorescencia aumenta proporcionalmente a la concentración del amplicón. La máquina de PCR recoge la información para cada muestra en cada ciclo, generando una gráfica donde se representa la fluorescencia frente al número de ciclos.

MX3000P REAL-TIME PCR SYSTEM Elimina la variación óptica, asegurando la intensidad de excitación uniforme y medida de las emisiones entre pocillos, en toda la placa.

4 MX3000P REAL-TIME PCR SYSTEM Elimina la variación óptica, asegurando la intensidad de excitación uniforme y medida de las emisiones entre pocillos, en toda la placa. Elimina la necesidad de corregir la señal entre pocillos mediante reference dyes. Permite una cuantificación correcta tanto de genes con poca expresión como muy abundantes. El Software para el análisis de los datos MxPro tiene una interfaz muy intuitiva, permite diseñar experimentos rápidamente y genera los resultados de forma fácil.

Ct(dRn) MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN Cuantificación absoluta: El objetivo del proyecto es medir la cantidad exacta de DNA en la muestra Curva estándar o absoluta Ct = 18 Initial Quantity (nanograms)

5 Ct(dRn) MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN Cuantificación absoluta: El objetivo del proyecto es medir la cantidad exacta de DNA en la muestra Curva estándar o absoluta Ct = 18 Initial Quantity (nanograms) Initial [DNA] = X Cuantificación relativa: Determinación relativa de la expresión de un gen de interés (GOI) en una muestra desconocida en relación a un calibrador o muestra control. No es necesario hacer una curva estándar en cada placa Los resultados se expresan como porcentaje de inducción o represión de la muestra desconocida con respecto al calibrador. Es conveniente normalizar los resultados con un gen de referencia.

a un desactivador de fluorescencia (sondas TaqMan

6 ELECCIÓN DEL COMPUESTO FLUORESCENTE Sondas de secuencia específica asociadas a un fluoróforo y a un desactivador de fluorescencia (sondas TaqMan ) Colorante de unión a DNA no específico (SYBR Green)

7 DISEÑO DE PRIMERS Diseño de primers Primer3:

8 DISEÑO DE PRIMERS Chequeo de la calidad de los primers: GeneRunner

9 OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PRIMERS Para la mayoría de las aplicaciones se recomienda un rango entre nM 300 nm 100 nm 50 nm

10 CHEQUEO DE LA CALIDAD DE LOS PRIMERS Amplifican un solo producto No se forman dímeros de primers

11 CHEQUEO DE LA CALIDAD DE LOS PRIMERS

12 OPTIMIZACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR Concentración de cdna adecuada CURVA ESTÁNDAR Muestras: NTC 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 x duplicado pocillo x triplicado de placa

13 OPTIMIZACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR Eficiencia de la reacción Precision de la reacción Sensibilidad de la reacción Pediente de la recta: (-3.1) - (-3.6) Eficiencia: % Rsq: > 0.985

14 DISEÑO DE LA PLACA

15 DISEÑO DEL PROGRAMA DE TEMPERATURA

mismo incremento de fluorescencia Threshold cycle (Ct): Número de

16 ÁNALISIS DE LOS DATOS Ajustar la línea base o threshold : Se debe ajustar en un punto donde todas las muestras analizadas muestren el mismo incremento de fluorescencia Threshold cycle (Ct): Número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente alcance el valor umbral.

17 ÁNALISIS DE LOS DATOS Método del 2-ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001) ΔCt (muestra) = Ct (muestra) Ct (normalizador) ΔCt (calibrador) = Ct (calibrador) Ct (normalizador) ΔΔCt = ΔCt (muestra) ΔCt (calibrador) Proporción de expresión relativa = 2 -ΔΔCt

18 Expresión relativa (número de veces) Expresión relativa (número de veces) Expresión relativa (número de veces) REPRODUCIBILIDAD DE LA TÉCNICA Expresión del gen FAD2-2 a lo largo del desarrollo y maduración del mesocarpo de aceituna en la variedad Picual 12 Año 2006 Año Tiempo (SDF) Tiempo (SDF) Tiempo (SDF)

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