Determinación de patógenos en Alimentos por Biología Molecular Hugo Mingo Agilent Technologies Jesús García Microbial System

Transcripción

1 Determinación de patógenos en Alimentos por Biología Molecular Hugo Mingo Agilent Technologies Jesús García Microbial System

2 Introducción a la PCR Se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas Las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína,, Polimerasas de m.o Thermus aquaticus (polimerasataq) Pyrococcus furiosus (Pfu) Thermococcus litoralis (Vent) Thermus termophilus (Tth). Page 2

3 Introducción a la PCR Los 7 componentes de una PCR: 1-Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dntp), sustratos para polimerizar nuevo ADN. 2-Dos cebadores o iniciadores (primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 6 y 40 nucleotidos. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia,definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. -Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. -La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas. -Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos. 3-Se suele usar magnesio (Mg 2+ ) Cofactores de la polimerasa. 4-Una solución tampón (buffer) que mantiene el ph adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. 5-ADN polimerasa 6- ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. 7-Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. Page 3

4 Introducción a la PCR Inicio C 1-9 minutos Desnaturalización(94-95 C) 60 seg La temperatura depende: de la proporción de G+C y longitud de la hebra Alineamiento40-68 C durante segundos El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Elongación PCR; 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas. El tiempo de extensión depende + ADN polimerasa +Longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. **A la temperatura óptima la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto polimerasa Taq C Elongación final C 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. -Electroforesis en gel de agarosa fragmentos grandes -Gel de acrilamida...fragmentos pequeños *Marcador de peso molecular Page 4

5 Introducción a la PCR Page 5

6 PCR a tiempo real: introducción Técnica de alta sensibilidad que permite la detección y cuantificación de un producto de PCR en tiempo real. Amplio rango de aplicaciones: análisis de expresión génica, determinación de carga viral, determinación de GMOs, genotipado de SNPs Basada en el uso de fluoróforos (termociclador) light light

7 Detección de productos Colorantes que se unen al ADN SYBR Green I, EvaGreen, LCGreen, SYTO9 Sondas específicas marcadas TaqMan Molecular Beacons Sondas FRET Taq Taq

8 Colorantes SYBR Green SYBR Green: Se une al surco menor del ADN de doble cadena Fluorescencia muy baja cuando no está unido 1000x cuando se une al ADN Ventaja: analizar muchos genes Desventaja: poca especificidad

9 Sondas específicas Taqman Reporterdye Acceptordye (Quencher) unbound probe free in solution Sondas específica con fluoróforo y quencher. Light energy transfer Light emission Desventaja: diseñar una sonda para cada target Taq Light Light emission Ventajas: alta especificidad Permite multiplex: varios target en la misma reacción Taq

10 Sondas específicas Molecular Beacons Estructura de pinza Fluorescencia cuando anilla con el molde

11 Sondas específicas Sondas FRET fluorescence resonance energy transfer Fluoróforo donante Fluoróforo aceptor Dos sondas que hibridan próximas Excitación Transferencia Emisión Suelen llevar fluoróforos compatibles solo con algunos equipos

12 Resumen fluoróforos Amplia variedad de fluoróforos, permite multiplex Compatibles con el equipo y espectros de emisión distintos Fluoróforo Excitación máxima (nm) Emisión máxima (nm) Oregon Green FAM SYBR Green TET JOE VIC HEX Cy ROX Cy Texas Red

13 Términos básicos Línea base: nivel de ruido de los primero ciclos donde no hay incremento detectable de la fluorescencia. Treshold: determinado valor de fluorescencia en la región exponencial de la curva de amplificación Treshold cycle (Ct): ciclo en el que la curva de amplificación alcanza el treshold. Permite calcular el material inicial de partida Señal reporter: señal fluorescente generada por el fluoróforo durante la reacción. Señal normalizada (Rn): intensidad la señal reporter dividida entre la señal del colorante de referencia pasivo

14 Métodos Múltiples aplicaciones: Partiendo de ARN (valorar niveles de expresión, carga viral ) El ARN se transcribe a cadn RT-PCR en 2 pasos Varias PCRs a partir de una RT Flexibilidad en los primer para la RT Almacenamiento de cadn RT-PCR en 1 paso Manipulación más simple Rápido Bajo riesgo contaminación Partiendo de ADN (detección de patógenos, GMOs, genotipado SNPs) June, 2008 Page 14

15 Tipos de cuantificación PCR convencional: la mayoría de reacciones habrán alcanzado la fase de plato de la amplificación. Real-time PCR nos asegura estar en la fase exponencial. Tipos de cuantificación: Absoluta: determinamos la cantidad total del gen de interés, expresado en valores de número de copia o concentración Relativa: determinaremos una relación entre la cantidad del gen de interés respecto a un gen endógeno de referencia.

16 Cuantificación absoluta Standard curve R 2 = Slope = Amplification efficiency = 98.2%

17 Cuantificación relativa Gen endógeno de referencia: su expresión no varía entre las distintas condiciones experimentales (genes housekeeping: β-actina, 18s RNA ) Método Ct de cuantificación relativa: Ct (muestra problema)= Ct gen target- Ct gen referencia Ct (calibrador)= Ct gen target- Ct gen referencia Ct= Ct (muestra problema)- Ct (calibrador) Nivel de expresión= 2 Ct

18 Instrumentos The Stratagene Mx Platform es una plataforma flexible, tanto a nivel de fluoróforos con de aplicaciones.

19 Hardware Specifications Quartz tungsten-halogen lamp 1 PMT detector 2 customizable filter wheels nm excitation nm emission 14 (33cm) W x 20 (46) D x 18 (43) H 45 pounds (20.4 kilograms)

20 Instrumentos Emission filter wheel Hot top Excitation filter wheel Thermal system Tungsten/Halogen Lamp Mx3000P/Mx3005P Fiber optic cable and scanning arm

21 Instrumentation Más de 10 años de experiencia en instrumentos de real-time QPCR Posibilidad de elegir la configuración de filtros que necesitas. Sistema de excitación: lámpara halógena Sistema óptica que escanea pocillo a pocillo Placa de 96 pocillos 4 colores (Mx3000P ) or 5 colores (Mx3005P ) Sistema de detección: PMT Recuperación de datos en caso de fallo en el ordenador

22 Instrumentos Sistema térmico Uniformidad de temperatura: (+/ C). Sistema térmico Peltier Rampa de temperatura: hasta 2.5 C/s Hot Top. others Mx3005 Variation of amplicon T m Herrmann et al., Clin. Chem. 52 (2006) and 53 (2007)

23 Instrumentos - Óptica Emission filter wheel 4 or 5 filters Halogen lamp Excitation range nm Excitation filter wheel 4 or 5 filters Photomultiplier Highly sensitive detection of fluorescence Fibre optics cable

24 Optics Excitation Quartz-tungsten halogen Range of nM 4 or 5 filter sets e - hν Emission Photomultiplier tube (PMT) Range of nm detection Filters before the PMT blocks cross-talk

25 Escaneado vs. iluminación y detección Asynchronous (scanning) Constant intensity (No positional effects) Simultaneous (CCD) Intensity depends on well position Lamp Higher intensity lower intensity 3.5 s scanning time per dye

26 Excitation range: 350 to 750 nm Emission range: 350 to 700 nm Real-time PCR Instrumentos Fluoróforos detectados TET HEX TAM TxRd Alx350 Atto425 FAM JOE Cy3 ROX Cy5 Standard filter set on Mx3005P Mx3000P Elige la combinación de filtros que necesites!

27 MxPro QPCR Software Software para el manejo del equipo y tratamiento y análisis de datos. Intuitivo, fácil de usar, incluso para nuevos usuarios de QPCR. Se pueden ver y analizar datos en tiempo real. Se pueden exportar gráficos a Excel & PowerPoint, en formato de texto y también las imágenes MEA Multiple experiment análisis: analizar varias carreras en un único proyecto.

28 MxPro Software: flexible y fácil de usar

29 Utilization of the Stratagene Mx3000P QPCR System for the Detection and Quantification of Mycotoxigenic Fungi Standard curves generated for Aspergillus, Penicillium, and Fusarium. A mixture of DNA from A. flavus, P. chrysogenum, and F. verticilliodes was serially diluted 10-fold and analyzed by the genus-specific multiplex real-time PCR. The initial DNA concentration was 10 ng/μl for A. flavus, P. chrysogenum, and F. verticillioides. Analysis of stored distiller s grain (DG) by multiplex real-time qpcr assay. Page 29

30 Fish Identification Methods Objective results More resistant to sample processing Easy to perform High specificity/sensitivity DNA-based methods Sequencing High initial investment (> 100K $) High maintenance costs Not usable with mixed samples Method of choice for new species PCR-RFLP Discrimination of highly related species Works with mixtures Low initial setup costs 30

31 Fish Identification Kit - Workflow Sample purification Amplification of species ID target Generation of specie specific patterns < 1 h (depends on # samples) ~ 1.5 h Pattern analysis using RFLP Decoder Software ~2.5 h ~ 6 h from sample to result < 1 h (depending on # samples) 31