Amplificación de Nucleó.dos Reacción en Cadena de la Polimerasa

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Josefa Ríos Naranjo
hace 8 años
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1 Amplificación de Nucleó.dos Reacción en Cadena de la Polimerasa

2 Historia de la PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa 1983: Kary Mullis tuvo la idea de PCR mientras trabajaba para Cetus Corpora.on in California $10,000 dólares de bono! Dado por la corporación Cetus Premio Nobel en 1993 Incluía componentes ya existentes: nucleó.dos, polimerasa, DNA Mullis agregó el concepto de usar un primer (iniciador o cebador) específico para la región de interes En 1971 Actualmente la patente pertenece a Hoffmann La Roche Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

3 La PCR ha tenido un gran impacto cien_fico Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

4 La PCR está protegida por patentes Actualmente la patente pertenece a Hoffmann La Roche Libre para usos específicos h]p://biochem.roche.com/ PCRlicense.htm Para inves.gación sin fines de lucro, es libre Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

5 PCR Funcionamiento h]p://en.wikipedia.org/wiki/polymerase_chain_reac.on h]p://

6 PCR Componentes Básicos Buffer General [dntp] : um menor [dntp] y [Mg] = mayor fidelidad [MgCl] : mm Contenido en buffer generalmente [Primers] : um > 800bp, +GC [Polimerasa] : Según proveedor [DNA] : 25 50ng/ul (en TE o agua) Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling (Biomol) PCR Muta.on Detec.on Protocols Theophilus Rapley 2002 Humana

7 PCR Reacción Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

8 PCR Reacción (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

9 PCR Reacción para amplicones dificiles puede variar Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling (Biomol) PCR Muta.on Detec.on Protocols Theophilus Rapley 2002 Humana

10 PCR Programa Típico 1. Desnaturalización a 95ºC x 4 minutos 2. Alrededor de 30 Ciclos (25 40) 1. Desnaturalización a 95ºC x 1 minutos 2. Alineamiento a alrededor de 50ºC x 1 minuto (depende de los primers, T m 5ºC) 3. Amplificación a 72ºC x 1 minuto (depende de la polimerasa, 30s 2m, 1m x 1kbp) 3. Extensión Final a 72ºC x 7 10 min 4. Mantener a 4ºC Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

11 PCR Equipo Flujo Disposal Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

12 PCR Curva de Crecimiento Teórica Teóricamente, la secuencia blanco se duplica en cada ciclo Si se inicia con A moléculas, en el siguiente ciclo se tendrán 2 * A moléculas Después de C ciclos, se tendrán A * 2 C moléculas Si 2 10 = 1024, cada 10 ciclos tenemos aprox veces más la can.dad inicial

13 PCR Curva de Crecimiento Observada h]p:// pcr.com/ h]p://online.haematologica.org/e le]ers/2002_04/19f1.htm

14 PCR Discu.r en equipos Porque no se observa la curva teórica? Que puede Fallar? Como diseñar experimentos para ver que está fallando?

15 PCR Visualización de los productos amplificados h]p:// 530.asp

16 PCR Visualización (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

17 PCR Visualización de los productos amplificados Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling (Biomol) PCR Muta.on Detec.on Protocols Theophilus Rapley 2002 Humana

18 Ejercicio Simulación de PCR en Excel Usar Molecular weight = (329.2 * number of G's) + (313.2 * number of A's) + (304.2 * number of T's) + (289.2 * number of C's) h]p://

19 PCR Aislamiento de amplicones (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

20 PCR Purificación de Amplicones (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

21 PCR Fallas Primers Misspriming Varios Productos visualizados Usar Hot Start o hielo Primers No priming No productos visualizados Contaminación Se deben incluir controles: No Template Control (Control Nega.vo) Si se ve Primer Dimer Control Posi.vo Se debe ver, si no, Rx mal Contaminación mas común: PCR previos Separar Áreas Usar UV Usar Cloro (7mM hipoclorito de sodio, bleach ) Usar dutp en conjunto con UNG (uracil N glycosilase) Usar H

22 PCR Modificaciones Hot Start Hielo Cera Uso de enzymas ac.vas hasta calentar Mul.plex Long Products PCR Alta Fidelidad Touchdown / Stepdown Ciclos iniciales adicionales bajando las temperaturas RT PCR Siguiente Clase Traer Resumen: Real.me PCR for mrna quan.ta.on h]p:// mul.media/archive/00011/ BTN_A_05391RV01_O_11901a.pdf Compe..ve PCR Retro Transcrip.on PCR RNA cdna PCR Nested PCR 1er PCR inespecífico/preamplificacion, 2do PCR mas específico / sobre amp

23 PCR Modificaciones en Solventes

24 PCR Anidado Ejemplos (Nested PCR) (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

25 Retro Transcrip.on PCR (Promoter solo para sistemas de expression) (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

26 Real Time PCR 1 Copia? Tc (Threshold Cycle) X log10([template]) Y Tc (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

27 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET

28 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

29 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

30 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

31 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

32 Marcajes en RT PCR EtBr SYBR Green TaqMan Scorpion Beacon FRET (BioMol) Molecular Diagnos.cs Fundamentals Methods and Clinical Applica.ons Buckingham Flaws Davis

33 Usos generales de PCR y en diagnós.co Clonación Secuenciación Microarreglos Comparación de tamaños de productos Transfección Microsatélites Polimorfismos Detección del # Genes Amplificación Diferencial en mutaciones (minisecuencing, single nt ext) Hibridación

34 PCR Diseño de Primers El buen diseño de primers es crí.co para el funcionamiento deseado de PCR Consideraciones Localización (gen, mutación, etc) Tamaño del producto ( bp) Contenido de GC (40% 60%) Eficiencia y Especificidad Energía de apareamiento Longitud del primer (20 30 nt) Tm de ambos primers similar Eficiencia Cálculo de Tm Hairpin Primer Dimer Estabilidad del extremo 3 Repe.ciones Especificidad # de si.os potenciales de hibridación Tm baja

35 PCR Diseño de Primers Según Autores PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology, v. 192 Humana Chen Janes

36 PCR Diseño de Primers Tm Mel.ng Temperature Tm Temperatura a la cual ½ de los primers está hibridado con la secuencia blanco Método de Vecinos para ΔH y ΔS Tm = {ΔH / ΔS + Rln(c)} Log [Na + ] c es la concentración del primer R cte univ gases (1.987Cal/ C*Mol) [Na + ] = 4 * [Mg +2 ]2 Hay varios métodos para calcular ΔH y ΔS T. Alineamiento se inicia con Tm 5ºC También: Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

37 PCR Diseño de Primers Tm Otros métodos sencillos para aproximar Tm h]p://

38 PCR Diseño de Primers Tm Si.os Web h]p:// biotools/oligocalc.html h]p:// mel.ng_temperature/demo.php Promega h]p:// calc11.htm NCBI h]p:// primer blast/index.cgi Google: calculator mel.ng temperature

39 PCR Diseño de Primers Hairpin Se toleran hairpins de baja energía de gibbs (ΔG) Entre 2 y 3 kcal/mol ΔG = ΔH TΔS Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling h]p://

40 PCR Diseño de Primers Primer Dimer Se toleran hairpins de baja energía de gibbs (ΔG) Entre 5 y 6 kcal/mol Self Dimer: igual Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling h]p://

41 PCR Diseño de Primers 3 End Más crí.ca para la eficiencia ΔG entre las úl.mas 5 bases Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling h]p://

42 PCR Diseño de Primers Especificidad Al menos hacer un BLAST del primer Methods In Molecular Biology Pcr Protocols Humana Bartle] Sr.rling

43 Especificaciones de una Polimerasa Ejemplo de PCR de Alta Fidelidad h]p:// PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology, v. 192 Humana Chen Janes

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