Técnicas de marcado no radioactivo

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Víctor Manuel Olivera Navarro
hace 6 años
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1 Sondas moleculares Técnicas de marcado no radioactivo Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana Universidad Nacional de Quilmes

2 Sondas moleculares Fragmento de DNA o RNA (marcado) de tamaño variable (100 a 1000 nt) utilizados para detectar la presencia de secuencias blanco mediante su apareamiento específico.

3 Sondas moleculares Aplicaciones Identificar clones específicos en bibliotecas genómicas y de cdna (Dot blot, Slot blot). Definir la ubicación de regiones específicas de DNA genómico (Southern blot). Analizar la transcripción y el procesamiento de RNA (Northern blot, mapeo de transcriptos con nucleasa S1, RPA). FISH (fluorescence in situ hibridization) y Microarray.

4 Hibridación de ácidos nucleicos BLANCO SONDA DNA o RNA inmovilizado en una membrana DNA o RNA marcado (generalmente derivado de una construcción genética)

5 Hibridación Blanco: desconocido. Fase sólida Sonda: conocida. Fase móvil

6 Marca de la sonda

7 Marca de la sonda

8 Marca de la sonda

9 Marca no radioactiva Nucleótidos acoplados a moléculas (Digoxigenina, Biotina, Fluorocromo, Cromógeno, entre otras) o enzimas (Peroxidasa, Fosfatasa alcalina, entre otras). Para obtener la sensibilidad equivalente a la que se obtiene con una marca radioactiva, se utilizan enzimas que amplifican la señal generada.

Marca no radioactiva Digoxigenina (DIG): esteroide hallado únicamente en flores y

participa en la generación de energía bioquímica durante la respiración aeróbica,

10 Marca no radioactiva Digoxigenina (DIG): esteroide hallado únicamente en flores y hojas de la planta Digitalis purpurea, Digitalis orientalis y Digitalis ianata. Biotina: conocida como vitamina H o B7. Es necesaria para el crecimiento celular, la producción de ácidos grasos y participa en la generación de energía bioquímica durante la respiración aeróbica, entre entras funciones. Fluoresceína: Compuesto orgánico sintético disponible como un polvo naranja-rojo soluble en agua y alcohol.

11 Marca no radioactiva

12 Marca no radioactiva

13 Técnicas moleculares para generar sondas. En general, las técnicas más utilizadas para el marcado de sondas no radioactivas están basadas en metodologías que involucran síntesis de ácidos nucleicos. Polimerasa Nucleótidos Requerimiento DNApol-DNAdep DNApol-RNAdep dntps Oligonucleótido con 3 OH libre RNApol-DNAdep rntps Secuencia promotora

14 Técnicas moleculares para generar sondas Nick translation Primer extension Multipriming Fill-in PCR Transcripción in vitro

15 Técnicas moleculares para generar sondas Técnica Polimerasa Nucleótidos Iniciador Sonda. Nick translation DNApolI dntp s Molde DNA Multipriming Frag. Klenow dntp s Hexámeros DNA Fill-in Frag. Klenow dntp s Molde DNA PCR Taq pol dntp s Primer específico DNA Primer extension Frag. Klenow dntp s Primer específico DNA Clonado M13 DNApolI dntp s Primer del vector DNA Transcripción RNApol rntp s Secuencia promotora RNA

16 Técnicas moleculares para generar sondas Utilización de kits comerciales ARES DNA labelling kits: Método en dos pasos. Incorporación de una amina modificada al DNA (mediante polimerización, transcripción reversa, nick translation, y otros) Marcado químico de la amina modificada usando un colorante comercial (Alexa Fluor dye). Para FISH y Microarray. Biotin DecaLabel TM DNA labelling kits Síntesis de DNA marcado con Biotina. Utiliza random primers (10 bases) y Klenow para incorporar nucléotidos marcados en la cadena sintetizada. La sonda puede ser detectada utilizando cualquier sistema biotina-avidina, biotina-streptavidina. Alkphos direct: Utiliza la enzima fosfatasa alcalina. Une la enzima a los nucleótidos tanto de DNA como de RNA. Mide la generación de producto mediante colorimetría o mediante quimiofluorescencia. ULYSIS Nucleic acid labelling kits Utiliza un colorante de platino que forma una unión estable con la posición N7 de guanina. La reacción lleva 15 minutos y la separación de las moléculas marcadas de las no marcadas se realiza mediante la utilización de una columna cromatográfica.

17 Técnicas moleculares para generar sondas ARES DNA labelling kits

18 Técnicas moleculares para generar sondas ULYSIS Nuclei acid labelling kits

19 Marca no radioactiva Fosfatasa alcalina: es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. Puede ligarse a nucleótidos, y luego se detecta su presencia mediante quimioluminiscencia (5-10 ng/ml) o colorimetría (50 ng/ml). Puede utilizarse para marcar oligonucleótidos mayores a 50 pb. Se utiliza para marcar fragmentos de DNA y de RNA. CDP-Star utiliza la enzima unida al nucleótido para catalizar la descomposición dioxetano, utilizado como sustrato de dicha reacción. ECF se utiliza junto con un instrumento para escanear fluorescencia. NBT/BCIP se utiliza como reactivo de detector de color.

20 Marca no radioactiva Marcadores de quimioluminiscencia: miden la generación de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). Luminol y derivados, es una diacilhidracida cíclica. La reacción requiere la presencia de un oxidante fuerte (H 2 O 2, ClO - o MnO 4 ) y de un catalizador (cu 2+, Fe 2+ o el grupo Hemo). Ester de acridina, es mejor que el luminol, ya que la reacción se produce sólo con la presencia de H 2 O 2 en un medio alcalino. Lucigenina, Emite luz cuando tiene lugar la reacción de oxidación por el peróxido de hidrógeno en una solución básica y en presencia de iones metálicos catalizadores como Pb2+.

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