H TRITIO MARCAJE DE PROTEÍNAS EN CÉLULAS

Transcripción

1 Disolución stock 1mCi Forma química: Solución acuosa de [6 3 H]-Timidina Vida Media: 12, 4 años 50 µci Marcaje ADN de las células Solubilización de las células Contador β 3 H TRITIO MARCAJE DE PROTEÍNAS EN CÉLULAS puntas micropipeta, viales, guantes y papel Viales con líquido de centelleo Medio de cultivo de células, lavados Eliminación de líquidos: Eliminación de sólidos y mixtos: 1,76 MBq/exp= residuo líquido 90Bq/exp= residuo sólido y mixto Protocolo 1

2 Disolución stock 1mCi Forma química: Solución acuosa de DL-[4,5-3 H]-Leucina Vida Media: 12, 4 años 50 µci Marcaje proteína de las células Solubilización de las células Contador β 3 H TRITIO MARCAJE DE ADN EN CÉLULAS puntas micropipeta, viales, guantes y papel Viales con líquido de centelleo Medio de cultivo de células, lavados Eliminación de líquidos: Eliminación de sólidos y mixtos: 1,76 MBq/exp= residuo líquido 90Bq/exp= residuo sólido y mixto Protocolo 2

3 Disolución stock 9,25 MBq, 250 µci 0.37 MBq, 10µCi 5 - [P -32 ]-P Fósforo-32 MARCAJE DE ADN Forma química: Solución acuosa de sal trietilamónica de 5 - [P-32]- trifosfato de adenosina Vida Media: 14 días Eliminación residuos sólidos: Almacenaje en recipientes protegidos por metacrilato hasta que la actividad sea el 10-20% de la original Eliminación de residuos líquidos: como los sólidos Marcaje de los extremos con 5 -fosfato con polinucleótidoquinasa Separación de los fragmentos de ADN en geles desnaturalizantes de poliacrilamida-urea Secado del gel puntas micropipeta, Mini-columnas de purificación Tampón de la electroforesis, lavados con etanol al 70% Protocolo 3

4 Forma química: Disolución stock 1 mci Solución acuosa de H 3 32 PO 4 Vida Media: 14,3 días Eliminación residuos sólidos: Almacenaje en recipientes protegidos por metacrilato hasta que la actividad sea el 10-20% de la original Eliminación de residuos líquidos: como los sólidos 1 mci Marcaje de proteína de las células Solubilización de las células Electroforesis en gel de poliacrilamida Secado del gel Fósforo-32 Fosforilación de proteína en células puntas micropipeta, viales, geles, guantes y papel Tubos eppendorf con parte del solubilizado Tampón de la electroforesis, Medios de cultivos de células, tampón de electroforesis MBq/exp= residuo líquido 7.4 MBq/exp= residuosólido y mixto Protocolo 4

5 Forma química: Disolución stock 250 µci Solución acuosa en sal de trietilamonio de desoxiadenosina 5 -[a- 35 S]-tiotrifosfato Vida Media: 87,4 días Eliminación residuos sólidos: Eliminación de residuos líquidos: 250 µci Marcaje de ADN de las células Solubilización de las células Electroforesis en gel de poliacrilamida Secado del gel 35 S AZUFRE-35 Marcaje de ADN en células puntas micropipeta, viales, geles, guantes y papel Tubos eppendorf con parte del solubilizado Medios de cultivos de células, lavados y tampón de electroforesis. 7.4 MBq/exp= residuo líquido 1.85 MBq/exp= residuosólido y mixto Protocolo 5

6 Disolución stock 1 mci 40 µci Marcaje de proteínas con Metionina 35 S para métodos de Pull-down Forma química: L-[ 35 S] metionina en solución acuosa con 0.1% 2-mercaptoetanol y 20 mm de acetato potásico. Vida Media: 87,4 días Eliminación residuos sólidos y líquidos: Almacenar durante un periodo mínimo de 6 meses y posteriormente eliminar Marcaje de proteinas con traducción in-vitro Pull-down con GST-proteinas Separación de proteínas marcadas por electroforesis en gel de poliacrilamida Secado del gel Tubos eppendorf, viales, guantes y papel Tubos eppendorf con parte de la solución acuosa de traducción de proteínas in vitro. Sobrenadante del pull-down con proteína marcada no unida y tampón de electroforesis µci/exp= residuo líquido Almacenamiento durante 6 meses 1-20 µci/exp= residuo sólido y mixto Almacenamiento durante 6 meses Protocolo 6

7 Forma química: Disolución stock 10 µci [ 125 I] Protein A en el reactivo de Bolton y Hunter Vida Media: 60 días Eliminación residuos sólidos y líquidos: Los residuos se recogen en los contenedores adecuados y se eliminan en consecuencia. 3 µci Incubación de la membrana para detectar anticuerpo unido Lavado del exceso de tampón de la membrana mediante papel de blotting 3* Lavado de la membrana Detección de proteína A marcada con 125 I de los complejos inmunológicos en los Western Blots guantes Papel de blotting con parte del tampón de lavado. Tampón de lavado. La solución de proteina A se reutiliza 3-5 veces y puede guardarse como mínimo un mes. 1 µci/exp= residuo líquido Almacenamiento durante 6 meses Max: 4 µci/año >0.5 µci/exp= residuo sólido y mixto Almacenamiento durante 6 meses Max: 0.5 µci/año Protocolo 7

8 Forma química: Disolución stock 1 mci Solución auosa de NaOH Vida Media: 59.6 días Eliminación residuos sólidos y mixtos: Almacenar durante un año contenedores de plomo y posteriormente eliminar. Marcaje de la proteína con Iodogen. Separación del Yodo no incorporado por cromotografía en columna 100 µci Experimentos de binding con diferentes tejidos Contaje en contador de radioactividad gamma 125 I Yodo-125 Marcaje de proteinas y experimentos de Binding Tubos eppendorf, viales, columnas guantes y papel. Tubos eppendorf con diferentes fracciones de la separación en columna 3,5*10 4 Bq/10 marcajes = residuo sólido y mixto 5*10 2 Bq/30 exp binding = residuo sólido y mixto Almacenamiento durante 1año Max: 5.6*10 2 Bq/año Protocolo 8