Bioquímica III- 2009

Transcripción

1 Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata Bioquímica III Trabajo Práctico Nro 4 Extracción de RNA y DNA bacteriano INTRODUCCIÓN El RNA es el ácido nucleico más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una célula típica contiene 10 veces más RNA que DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa, que posee un grupo hidroxilo (OH) libre en la posición 2'. Este grupo participa en la formación de un intermediario en el mecanismo de hidrólisis y determina que el RNA sea químicamente inestable, y se hidrolice fácilmente en una solución acuosa alcalina. En la mayor parte de los casos, el RNA es un polímero monocatenario (ssrna), pero las secuencias nucleotídicas de estas moléculas poseen, en mayor o menor medida, regiones complementarias que determinan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria en forma de dsrna). Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catálisis alcalina, pero la mayoría de estas enzimas atacan exclusiva- o preferentemente la ssrna. Cuando se desea clonar un determinado gen para luego analizar su expresión resulta de mucha importancia la obtención de preparaciones de RNA limpias y que contengan moléculas intactas. El RNA proveniente de cualquier célula puede ser copiado a moléculas de DNA de doble hebra y estas luego pueden ser clonadas en un vector resultando en la producción de bibliotecas de cdna específicas del tipo celular en cuestión. Para que estos clones sean útiles en el análisis resulta crítico que se cuente con RNAs íntegros y completos como material de partida. La mayor dificultad para la obtención de dichas preparaciones es que la mayoría de las RNAsas, que degradan nuestras moléculas de interés, son enzimas muy estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequeña cantidad de las mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparación puede constituir un verdadero problema. Existen tres pasos fundamentales en la extracción de un ácido nucleico (DNA o RNA): 1) Homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura tisular y celular para facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Dentro de los métodos para la homogenización podemos mencionar los físicos como la sonicación, hervido, congelación-descongelación, choque osmótico, etc; los químicos como la utilización de detergentes (SDS) y también los enzimáticos como la lisozima, la proteinasa K, etc. El agregado de quelantes de magnesio, como el EDTA, a las soluciones de extracción contribuye también a la reducción de la integridad de las membranas. 2) Separación y Purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio. Dentro de las metodologías utilizadas las más comunes son la extracción con mezclas de fenol-cloroformo y la separación cromatográfica. En el caso del fenol-cloroformo, el primero se utiliza para la desnaturalización y solubilización de las proteínas y componentes celulares y el cloroformo permite la separación de las fases durante la centrifugación, además de también ser desnaturalizante. Cuando lo que se utiliza es una separación cromatográfica generalmente se recurre a columnas preempaquetadas ya sea de afinidad o de intercambio iónico previa unión del ácido nucleico a resinas o matrices de sílice. Estas son lavadas varias veces para eliminar contaminantes y posteriormente se procede a la elución del ácido nucleico. 3) Precipitación: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización. Este paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volúmenes de etanol. 1

2 Se pueden mencionar muchas metodologías para la extracción de DNA y RNA de las células en función del tipo de muestra (células procariotas o eucariotas, vegetales, animales, etc) y del grado de pureza que se quiera obtener condicionado por las técnicas posteriores de análisis. Extracción de DNA: Entre los métodos de purificación de DNA se destacan los que emplean gradientes de cloruro de cesio y los que incluyen extracciones con solventes orgánicos en presencia del detergente catiónico CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio). Los primeros tienen la ventaja de obtener DNA de muy buena calidad pero son muy trabajosos y requieren una cantidad importante de bromuro de etidio. Los protocolos con CTAB son más sencillos y se basan en la propiedad que posee este compuesto de solubilizar membranas celulares y complejar el DNA a bajas concentraciones de NaCl. En el caso del trabajo práctico realizaremos la recuperación del DNA genómico bacteriano a partir de una precipitación selectiva del RNA con LiCl utilizando una concentración de dicha sal que deja en solución al DNA. Extracción de RNA: Existen variadas metodologías para la extracción de RNA. Son bastante comunes los protocolos que incluyen isotiocianato de guanidinio o fenol para el lisado celular. Dichos compuestos inactivan RNAsas lo que resulta muy favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de RNAsas endógenas. Una de las metodologías más sencillas es la que utilizaremos en este trabajo práctico y consiste en la utilización de un detergente suave como es el SDS par el lisado de las células que se combina con el calentamiento de la muestra de manera de favorecer la solubilización del material. Posteriormente se realiza una desproteinización con cloroformo y una precipitación diferencial con LiCl 2M. Deben considerarse también a la hora de seleccionar una metodología de extracción los diversos y versátiles sistemas comerciales tipo kits para la extracción de DNA y RNA existentes en el mercado. Muchos de ellos se basan en procedimientos cromatográficos para la purificación. En la siguiente figura se muestran los principales pasos a realizarse cuando se utilizan columnas cromatográficas de este tipo: Posteriormente a la extracción del ácido nucleico de interés es necesario evaluar la cantidad y calidad del mismo. Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si el DNA no ha sufrido roturas veremos una única banda de alto peso molecular. Para el caso de muestras de RNA la corrida electroforética de preparaciones de buena calidad mostrará claramente los diferentes RNAs ribosomales y de transferencia. 2

3 rrna28s rrna18s mrnas Muestras de RNAs corridas en gel de agarosa 1% teñidas con bromuro de etidio rrna28s y rrna18s: RNAs ribosomales trna: RNAs de transferencia mrnas: RNAs mensajeros trna Para la cuantificación de los ácidos nucleicos aislados se realiza la medida de absorbancia de la muestra a 260nm y 280nm en un espectrofotómetro. Se sabe empíricamente que la densidad óptica a 260nm de una solución de DNA puro de doble cadena de 50ug/ml es igual a 1. Con esta relación puede calcularse la concentración de DNA de nuestra muestra. Para estimar la pureza de la muestra medimos la absorbancia a 280nm y calculamos la relación A260/ A280. Un DNA sin contaminantes tiene una relación de 1.8 a 2.0. Valores menores indican contaminación con proteínas mientras que valores mayores se deben a contaminación con sales. Para el caso del RNA la relación es de 40ug/ml para una unidad de absorbancia a 260 nm. La estimación de la pureza se realiza también utilizando la relación A260/ A280. RECOMENDACIONES: A la hora de trabajar con RNA, deben tomarse las máximas precauciones para evitar contaminaciones con RNAsas y la degradación del RNA. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNAsas, y debe tratarse todo el material para su eliminación: horneado del material de vidrio, tratamiento se soluciones acuosas con DEPC (dietilpirocarbonato, compuesto que inactiva las RNAsas por unión covalente). Debe usarse guantes a lo largo de todo el proceso ya que las manos son la mayor fuente de RNAsas. Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la manipulación. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Si es necesario acumular muestras antes de comenzar a procesarlas, se deben congelar tras su recolección en nitrógeno líquido y almacenarlas a -70 ºC. Una vez que las muestras han sido homogeneizadas en el Buffer de Extracción, pueden ser almacenadas a -70 ºC sin necesidad de congelación en nitrógeno líquido. Es importante utilizar RNA purificado recientemente. El almacenamiento del RNA a -70 ºC evita su degradación, y la conservación del RNA se ve favorecida si se re-precipita con acetato de sodio antes de colocarlo a -70 ºC para su almacenamiento. OBJETIVOS DEL TP Extracción de RNA y DNA genómico de un organismo procariota (E. coli). Comparación entre los distintos tipos de RNA. Establecimiento de las diferencias y similitudes entre los protocolos de extracción de RNA y de DNA y de su grado de pureza y calidad. ORGANIZACIÓN GENERAL Dentro de cada una de las comisiones, se generarán 6 grupos de trabajo. Cada uno de los grupos realizará dos tubos de extracción de RNA. El 2 do día del TP, se terminará con la extracción del RNA que se dejó precipitando desde el 1 er día del TP y se realizará la precipitación del DNA. 3

4 Técnicas Experimentales Día 1 Extracción de RNA total de bacteria Previamente calentar a 80ºC el Buffer de Extracción en un baño de agua, o fraccionar en tubos de 1,5ml y calentar en bloque. 1) Transferir 1,5 ml de cultivo de E. coli a un tubo de microcentrífuga (Eppendorf) y centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. 2) Retirar el tubo de la microcentrífuga, descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo y eliminar los restos de medio de cultivo tomándolos con una pipeta P ) Repetir la operación un total de 3 veces (de esta manera, se obtiene un sedimento de bacterias provenientes de 4,5 ml del cultivo). 4) Resuspender el pellet en 400 µl de Buffer de Extracción caliente y 400 µl de cloroformo, mezclar rápidamente por inversión. 5) Incubar 1 minuto a 80ºC. 6) Mezclar nuevamente el contenido del tubo con Vortex durante 1 minuto. 7) Centrifugar a máxima velocidad por 10 minutos. 8) Retirar el tubo de la microcentrífuga con cuidado para no mezclar las dos fases formadas: tomar la fase superior acuosa (aprox. 400 µl) y trasvasarla a un tubo estéril nuevo de 1,5ml. 9) Adicionar 1 volumen de LiCl 4M (aprox. 400 µl). 10) Incubar ON (OverNight) a 4ºC. Día 2 11) Centrifugar a máxima velocidad por 15 minutos. (De ser posible a 4ºC). Trasvasar el sobrenadante a un tubo estéril nuevo de 1,5ml y guardar (de aquí recuperaremos el DNA. NO TIRE EL SOBRENADANTE!) 12) Lavar el pellet con etanol 70%. Para ello, agregar 500 µl de etanol 70%, luego centrifugar a 14000rpm por 5 minutos, y por último, descartar el sobrenadante (eliminar los restos de etanol tomándolos con una pipeta P-200). 13) Dejar secar aproximadamente 5 minutos. 14) Resuspender en 50 µl de agua bidestilada estéril. Precipitación de DNA desde el sobrenadante 1) Precipitar el DNA con 1 volumen de isopropanol. 2) Centrifugar a máxima velocidad por 1 minuto. 3) Descartar el sobrenadante, y lavar el pellet con 500 µl de etanol 70%. Centrifugar 5 minutos a 14000rpm. 4) Dejar secar aproximadamente 5 minutos. 5) Resuspender en 50 µl de agua bidestilada estéril. Los docentes realizaran las corridas electroforéticas de las muestras extraídas y serán analizadas la siguiente semana. 4

5 SOLUCIONES EMPLEADAS Buffer de Extracción: Tris-HCl 100mM, ph= 8,0 EDTA 10mM, ph= 8,0 SDS 1 % LiCl 100mM Solución de cloruro de litio: LiCl 4M Preguntas Para el aprovechamiento del trabajo experimental es imprescindible saber exactamente qué se está haciendo en cada momento y por qué. Recuerde que la experiencia de laboratorio es intransferible y no la encontrará en ningún libro; por lo tanto las oportunidades desaprovechadas durante el trabajo experimental en el laboratorio difícilmente puedan recuperarse con posterioridad en la carrera. Es por ello que sugerimos resolver el siguiente cuestionario antes de venir al trabajo experimental. 1) Qué función cumple cada una de las soluciones utilizadas en el TP? 2) Cuál es el motivo de precalentar el Buffer de Extracción a 80ºC, y cuál es el fundamento de incubar a 80ºC? Se podría realizar la extracción a temperatura ambiente? 3) Cuando Ud. debe agregar 1 Volumen, cómo hace para determinar la cantidad? En caso de que no lo haya hecho en el paso anterior, cómo haría para saberlo de manera rápida? 4) Cómo determinaría si la fase superior en el punto 8) es verdaderamente la acuosa? Recuerde que debe ser de manera rápida ya que debe continuar con la experiencia. 5) Describa una manera fácil y rápida de determinar la concentración y pureza del producto purificado. 6) Con el método anterior Ud. ha determinado que tiene una alta concentración y pureza, Hay algún otro parámetro que sea necesario analizar antes de utilizar el RNA total purificado? 7) Describa brevemente las diferencias entre los RNAs de organismos procariotas y eucariotas. 8) Cuál es la abundancia aproximada de cada uno de los principales RNAs (mensajero, ribosómico, transferencia, pequeños nucleares)? Cómo espera ver esto experimentalmente. 9) Ud. es la/el mejor becaria/o que existe; sin embargo, entre halagos olvido rotular los tubos. Cómo podría determinar cuál contiene RNA y cuál DNA. Recuerde que está en juego su honor.. 10) No deje que los halagos lo distraigan, esta vez olvidó preparar con antelación el Buffer de Extracción. Decide prepararlo rápidamente y, para ello, cuenta con soluciones de Tris-HCl 1M con los siguientes phs 7,0; 7,5; 8,5 y 9,0. Cuál utilizaría y por qué? Podría utilizar una solución de EDTA 10mM ph 8;0? Por qué? 11) Describa brevemente experiencias en las que utilizaría RNA total purificado. Incluiría en ellas un mapeo de restricción? Por qué? 12) Uno de los principales inconvenientes es la contaminación con RNAsas; para ello hay que tratar todos los materiales y preparar de manera especial los reactivos. Mencione cómo lo hace. 13) Qué otras precauciones tomaría, además de las que tomó en el TP, para evitar contaminaciones o degradación del RNA? 14) Cuál es el fundamento de la purificación de DNA por medio de columnas comerciales? 17) Cuál es el coeficiente de Absorción molar del DNA y del RNA a 260 nm? Cómo podría determinar que una muestra de DNA está pura? Y una de RNA? 18) Cómo distinguiría si posee una muestra de de DNA contaminada con Fenol? Y si estuviera contaminada con Proteínas? Qué haría en cada caso? 19) Idem pregunta anterior pero para RNA. 5