ANTECEDENTES Epidemiología de la Tuberculosis

Transcripción

1 ANTECEDENTES Epidemiología de la Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis, que afecta a seres humanos de todas las edades (Palma y col., 2007; Rivas-Santiago y col., 2005), siendo la enfermedad que mayor número de muertes ha ocasionado en toda la historia de la humanidad (Caminero y col., 1996). Un tercio de la población mundial se encuentra infectada con esta bacteria (Vincenti y col., 2003; Weldingh y col., 2005) encontrándose más del 90% de todos los casos de tuberculosis en poblaciones de países con recursos limitados (Granich y col., 2000; Kabra y col., 2004). La magnitud de la enfermedad ha aumentado debido a la expansión del Virus de Imunodeficiencia Humana (VIH) que aumenta el riesgo de desarrollar tuberculosis (Kabra y col., 2004), al aumento en la prevalencia de diabetes y a la aparición de cepas multirresistentes a las drogas antituberculosas (Rivas-Santiago y col., 2005). En México, de acuerdo con cifras oficiales de la Secretaría de Salud, la tuberculosis ocupa el lugar 17 como causa de muerte en la población general en edad productiva (Palma y col., 2007). En el año 2000 se reportaron 15, 941 casos y, hasta la semana 28 del año 2006, se notificaron 7, 257 casos nuevos de tuberculosis en el país (Palma y col., 2007; Zenteno, 2003). Sonora se ubica entre los estados con mayor prevalencia de tuberculosis ( 3

2 Características Generales de Mycobacterium tuberculosis El agente causal de la tuberculosis fue descubierto en 1882 por Roberto Koch, es de aspecto bacilar recto y alargado, mide 0.4 x 3 µm (Ramírez y col., 2002), manifiesta un aspecto de cuentas irregulares que cuando se tiñe da la impresión de una serie de gránulos conectados entre sí (Ryan y col., 2004). Es un microorganismo intracelular obligado, aerobio, inmóvil (Ramírez y col., 2002) que crece a 37ºC, pero no a temperatura ambiente, requiere de medios de cultivo enriquecidos o complejos para desarrollarse de manera primaria (Ryan y col., 2004), es de crecimiento lento, y su pared celular contiene concentraciones elevadas de lípidos los cuales son los responsables de la tinción resistente al ácido que toman las bacterias con el colorante rojo carbol fucsina, razón por la que a estos microorganismos se les llama también ácido- alcohol resistentes (Abbas y col., 2004). La pared celular de Mycobacterium tuberculosis es una estructura compleja (Gorocica y col., 2005), posee un alto contenido de lípidos, proteínas y polisacáridos, es rica en ácidos micólicos unidos a glicolípidos (Ramírez y col., 2002). Los glicolípidos, junto con algunas proteínas son responsables de las características antigénicas de la bacteria (Gorocica y col., 2005). La pared micobacteriana consta de una pared gruesa, conformada por cuatro capas, la más interna es el glicopéptido o peptidoglicano; esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y rigidez (Ramírez y col., 2002). Externamente, hay otras tres capas compuestas, la primera por polímeros de arabinosa y galactosa, la segunda por ácidos micólicos (Ramírez y col., 2002) (a los cuales se les atribuye el carácter hidrofóbico de la envoltura) (Gorocica y col., 2005), y la tercera formada por lípidos como los sulfolípidos que se caracterizan por estar altamente glicosilados, dando lugar a moléculas como el lipoarabinomanano (LAM) (Ramírez y col., 2002), molécula compleja que se 4

3 extiende desde la membrana plasmática hasta la superficie celular y que tiene un papel fundamental en la patogénesis de la tuberculosis (Gorocica y col., 2005; Hayakawa y col., 2007) (Figura 1). Antígenos de Mycobacterium tuberculosis Los principales antígenos de las micobacterias pueden dividirse de forma general en dos grandes grupos: los solubles o citoplasmáticos y los insolubles ligados a la pared celular. Pero en relación a la naturaleza de los antígenos solubles se sabe que los hay de naturaleza proteica, lipídica y polisacárida (Ramírez y col., 2002). Las proteínas de Mycobacterium confieren la propiedad antigénica de la bacteria y para su estudio se han agrupado de acuerdo a su función, secuencia y caracterización. El primer grupo está formado por proteínas de estrés térmico (Ramírez y col., 2002), que incrementan su síntesis frente a estímulos estresantes como los cambios en la temperatura (Wiker y col., 1992) y la disminución de nutrientes; esta respuesta probablemente protege a la micobacteria durante situaciones adversas, manteniendo la conformación funcional de proteínas esenciales (Ramírez y col., 2002); un ejemplo de estas proteínas es la hsp65 para la cual se han desarrollado anticuerpos monoclonales altamente específicos (Wiker y col., 1992). El segundo grupo son las lipoproteínas, que incluye a las de 19 kda, y 38 kda (el antígeno micobacterial más estudiado), las cuales son constituyentes fundamentales de la pared celular pero pueden ser encontradas en el citoplasma; se considera que estas lipoproteínas están involucradas en la inducción de respuestas humorales y celulares (Ramírez y col., 2002; Wiker y col., 1992). 5

4 Figura 1. Representación esquemática de la pared celular de Mycobacterium tuberculosis. Fuente: Gorocica y col.,

5 Un tercer grupo son las proteínas secretorias, algunas de éstas forman parte del complejo 85 que es el mayor constituyente del sobrenadante de los cultivos del Mycobacterium tuberculosis (Ramírez y col., 2002), el cual ha sido estudiado por más de tres décadas (Wiker y col., 1992). La importancia de esta proteína se debe a su papel en la síntesis de la pared celular de la micobacteria (Rivas-Santiago y col., 2005). El último grupo, está constituido por las enzimas, entre ellas se encuentran la L-alanina deshidrogenasa de 40 kda y la superóxido dismutasa de 23 kda, que están involucradas en los mecanismos de defensa del bacilo dentro de los macrófagos (Palma y col., 2007; Ramírez y col., 2002). Proteínas del Filtrado de Cultivo de Mycobacterium tuberculosis Las proteínas de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis son aquellas que la bacteria libera al medio de cultivo en el que crece. En la mayoría de los casos, se desconoce el mecanismo de secreción y la función de las proteínas de filtrado (Smith, 2003). Una cantidad de estas proteínas secretadas al ambiente extracelular por la bacteria es blanco de la respuesta inmune del huésped infectado (Andersen y col.; 1991; Johnson y col., 2002;). Así, el filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis, ha constituido una fuente importante de antígenos que inducen inmunidad protectora (Palma y col., 2007), y el hecho de que se haya determinado la secuencia genómica completa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv brinda la confianza de explorar una mayor cantidad de antígenos (Bisen y col., 2003). Entre 1980 a 1990, S. Nagai y colaboradores purificaron varias proteínas a partir de cultivos líquidos de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis libres de células, entre las cuales se encuentran varias proteínas inmunodominantes especificas de Mycobacterium tuberculosis que por lo tanto 7

6 adquirieron rápidamente importancia diagnóstica (Johnson y col., 2002). El medio líquido que más se han utilizado para cultivar a Mycobacterium tuberculosis y estudiar su proteoma es el Sauton (Andersen y col., 1991; Nagai y col., 1991; Weldingh y col., 1998); sin embargo se han realizado estudios como el de Betts y col., que demuestran que la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis cultivada en el medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 es un modelo válido para el estudio de la bacteria en el laboratorio (Betts y col., 2000). Entre las proteínas de secreción más estudiadas, se encuentran las proteínas de 6, 10, 15, 18, 23, 27, 30, 31.5, 41 y 45 kda, algunas de las cuales forman parte del complejo antigénico 85 (Ramírez y col., 2002). Otros estudios han demostrado que las tres proteínas relacionadas estrechamente al complejo antigénico 85 (ag 85A de 32 kda, ag 85B de 30 kda y ag 85C de 32.5 kda) son las proteínas de Mycobacterium tuberculosis que más se secretan al medio de cultivo (Landowski y col., 2001; Lim y col., 2000). Por otro lado Achkar y col., en el año 2006 demostraron que la malato sintetasa de 81 kda y la proteína de 27 kda del filtrado de cultivo son reconocidas por los anticuerpos de pacientes con tuberculosis, tanto negativos al HIV como seropositivos, así como en pacientes con baciloscopía negativa (Achkar y col., 2006). Otro antígeno de secreción, el ESAT-6 de Mycobacterium tuberculosis, es un blanco inmunodominante en la fase temprana de la tuberculosis que contiene epitopos reconocidos por un número considerable de individuos. Se ha observado que esta proteína se expresa en cepas virulentas de Mycobacterium tuberculosis y no se expresa en cepas del bacilo BCG (Ernst y col., 2007; Ravn y col., 2005). Otro de los antígenos que ha destacado por las numerosas investigaciones llevadas a cabo con él, es la proteína de 38 kda, la cual es el mayor constituyente en el líquido de cultivo de Mycobacterium tuberculosis; los anticuerpos dirigidos contra esta proteína se presentan en un alto porcentaje en personas con tuberculosis y tiene una alta especificidad para la enfermedad activa. Sin embargo su aplicación masiva ha sido limitada por su sensibilidad variable, que es 45 a 85% 8

7 en diferentes cohortes de pacientes con tuberculosis (Palma y col., 2007; Ramírez y col., 2002) En la Tabla I, se muestran los antígenos proteicos antes citados, además de otros que han sido utilizados para el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin embargo, para mejorar la sensibilidad y especificidad que se alcanza con los antígenos puros, en diversos estudios se ha propuesto la utilización de una mezcla de varios antígenos inmunodominantes con la finalidad de cubrir la gama de respuestas inmunológicas inducidas por Mycobacterium tuberculosis en los individuos de diferentes poblaciones (Ramírez y col, 2002). Diagnóstico en el Laboratorio El diagnóstico clínico presuntivo de la tuberculosis, está basado principalmente en el análisis radiográfico, el examen clínico y la baciloscopía (Weldingh y col., 2005) para demostrar la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en los muestras biológicos. Para el diagnostico definitivo, se cultiva e identifica la especie infectante a partir de la muestra biológica del paciente (Palma-Nicolás y col., 2007). La baciloscopía está basada en la observación de bacilos ácido alcohol resistentes, es un procedimiento rápido, sin embargo tiene una sensibilidad baja (de 50 a 70 %), y requiere de una concentración de 10 4 bacterias por ml para generar un diagnóstico positivo (Vincenti y col., 2003; Zenteno, 2003), siendo la detección en niños y pacientes infectados con VIH aún más baja (Weldingh y col., 2005). El diagnóstico definitivo de la tuberculosis, se logra mediante el cultivo de la micobacteria, sin embargo, se requieren de 6 a 8 semanas para lograr el crecimiento de la bacteria y las colonias pigmentadas característcias (Kabra y 9

8 Tabla I. Principales antígenos proteicos utilizados para el desarrollo de pruebas para el diagnóstico de la tuberculosis. Antígeno Sensibilidad Especificidad Aplicación Estudio ESAT 27% TB latente Silva y col. CFP-10 25% 97% TB BAAR- Dillon y col. 16 kda 57% TB VIH+ Uma Devi y col. 30 kda 61% 95% TB pulmonar Sada y col. 38 kda 68% 96% TB pulmonar Espitia y col. 63% 90% TB VIH+ Ramalingam y col. Mtb % 93% TB VIH+ Lodes y col. TB % TB BAAR- Welding y col. 88% TB VIH+ Welding y col. 98% TB VIH- Welding y col. Mtb81 70% 99% TB VIH+ Hendrickson y col. UI (21 kda) 87.2% TB VIH+ Mukherjee y col. Fuente: Johnson y col., 2002; Palma y col.,

9 col., 2004; Weldingh y col., 2005) en medio sólido como el de Löwenstein- Jensen (Somoskövi y col., 1999). A pesar de esta desventaja, el cultivo de la bacteria es un método más sensible (de 80 a 85%) que la observación microscópica, al punto de que detecta 10 bacterias por ml (Vincenti y col., 2003). Cabe mencionar que el diagnóstico de tuberculosis infantil ha sido rodeado de incertidumbres, y que en ese caso ni siquiera el cultivo de la micobacteria es útil, ya que es difícil obtener muestras biológicas como esputo en los niños con tuberculosis (Araujo y col., 2004). Por ello, y en ausencia de un buen método de diagnóstico, continúa la búsqueda de pruebas rápidas, que no requieran de un especimen biológico obtenido del tejido afectado (Kabra y col., 2004). Al respecto, hasta hace pocos años se consideraba a la prueba de la tuberculina como el único medio práctico para la detección de infección por Mycobacterium tuberculosis en pacientes con tuberculosis activa y latente (Mori y col., 2004). Sin embargo, esta prueba tiene limitaciones significativas porque el derivado proteico purificado (PPD) usado para la prueba es un precipitado del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis que contiene mas de 200 antígenos compartidos de forma extensa por las micobacterias (Vincenti y col., 2003), incluyendo el bacilo de la vacuna Calmette Guerin (BCG) o por micobacterias no tuberculosas (Mori y col., 2004; Ravn y col., 2005). En los últimos años, se han desarrollado técnicas para el diagnóstico de la tuberculosis que se caracterizan por su buena sensibilidad y reproducibilidad, y por ser relativamente fáciles de estandarizar; estas técnicas incluyen las relacionada con la amplificación de ácidos nucléicos y los métodos inmunoquímicos (Weldingh y col., 2005, Zenteno, 2003). Los métodos moleculares basados en la amplificación de ácidos nucleicos, son técnicas rápidas, altamente especificas (del 95%), y más sensibles (del 45 al 77%) que el examen microscópico de esputo (Weldingh y col., 2005), aunque presentan la desventajas como la necesidad de contar con equipo especializado y personal 11

10 bien entrenado (Landowski y col., 2001). En contraparte, los métodos inmunoquímicos se basan (Pottumarthy y col., 2000; Singh y col., 2005) en la detección de los anticuerpos circulantes, por lo que la muestra biológica es la sangre del paciente. Esto conlleva la ventaja de no requerir una muestra del tejido infectado; además, para estandarizar las pruebas inmunoquímicas no se requiere de equipo especializado, aunque prevalece siempre la necesidad e contar con personal bien entrenado en su manejo (Landowski y col., 2001). Métodos Inmunoquímicos Para la Identificación de Anticuerpos Diversas técnicas de laboratorio utilizadas de forma habitual en la investigación y en la clínica, se basan en el uso de anticuerpos; la extraordinaria especificidad de los anticuerpos por sus correspondientes antígenos, los convierte en reactivos útiles para detectar, purificar y cuantificar dichos antígenos. Entre estos métodos se encuentran el ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) (Abbas y col., 2004), el método inmunoquímico de electrotransferencia e inmunodetección o Western blot (Abbas y col., 2004), y una variación de este método, el ensayo de manchas o Dot blot ( Se han realizado diversos, en los que se demostrado la utilidad de los inmunoensayos para identificar antígenos inmunodominantes en pacientes con tuberculosis y con lepra (Wiker y col., 1992). En relación con los ensayos serológicos aplicados para el inmunodiagnóstico de la tuberculosis (Araujo y col., 2004), se han desarrollado pruebas usando varios antígenos que son secretados al ambiente extracelular de la bacteria, como las proteínas de choque térmico, lipopolisacáridos y péptidos (Palma y col., 2007; Pottumarthy y col., 2000). También se han usado 12

11 combinaciones de diferentes antígenos reconocidos por anticuerpos específicos, para incrementar la sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas; ejemplos de los antígenos que han sido usados para tal fin, son el ag38 kda y el antígeno hsp60 (Araujo y col., 2004). La utilidad potencial de los métodos serológicos, en la detección de antígenos micobacteriales en muestras clínicas es de un valor incalculable y puede tener en el futuro aplicaciones adicionales, como el monitoreo terapéutico de los pacientes con tuberculosis (Ahmad y col., 1995). Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a una Enzima (ELISA) En la última década se han realizado estudios con antígenos de Mycobacterium tuberculosis para la medición de anticuerpos en el suero de pacientes con tuberculosis (Okuda y col., 2004). Así, se han detectado títulos de anticuerpos específicos para ciertos antígenos micobacteriales, no sólo en el suero sino también en el esputo y fluido cerebroespinal de los pacientes (Pereira y col., 2000). El ELISA, es un ensayo con pocos pasos: se coloca una cantidad fija del antígeno sobre la superficie de los pocillos de una placa de microtitulación, y después de bloquear los sitios de unión inespecífica, se adiciona una solución diluida de la muestra biológica del paciente; se realizan varios pasos para eliminar el anticuerpo no unido específicamente (Abbas y col., 2004) y, finalmente, la reacción antígeno-anticuerpo es visualizada usando un anticuerpo anti-humano unido a una enzima indicadora de la interacción específica que se busca. La enzima hidroliza a su sustrato, el cual oxida a su vez un cromógeno, provocando un cambio de color que se puede detectar y medir espectofotométricamente. Este ensayo puede tomar varias horas (Abbas y col., 2004) (Figura. 2), sin embargo tiene ventajas como la de poder ensayar al mismo tiempo varios sueros (Steingart y col., 2007). 13

12 Figura 2. Representación esquemática del ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA).Fuente: Abbas y col.,

13 Se considera al ensayo ELISA como una herramienta de gran utilidad para el diagnostico de tuberculosis, y como una técnica simple y no costosa, sin embargo presenta limitaciones por su sensibilidad especialmente baja en pacientes con baciloscopía negativa (Okuda y col., 2004). En el caso de la tuberculosis con baciloscopía positiva, uno de los antígenos con especificidad alta es el ag de 38 kda (>98%) y por ello se han desarrollado equipos serodiagnósticos ELISA, además se ha observado que los pacientes con tuberculosis avanzada tienen títulos elevados de anticuerpos anti-ag38 (Samanich y col., 2000). Las proteínas del complejo ag 85 también son fuertemente inmunogénicas, pero a diferencia de la anterior, se ha ensayado con resultados buenos usando el suero de pacientes con tuberculosis PPD negativos (Landowski y col., 2001). Electrotransferencia e Inmunodetección (Western blot) El Western blot se utiliza para determinar la cantidad relativa y el peso molecular de una proteína específica en una mezcla de ellas, en este método las proteínas primero son separadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente son transferidas a una membrana de soporte (nitrocelulosa u otro material adsorbente), mediante la aplicación de una corriente eléctrica (electrotransferencia); la corriente eléctrica se aplica en forma perpendicular al gel. La posición del antígeno proteico en la membrana puede detectarse gracias a su unión con el anticuerpo marcado específicamente para esa proteína, lo que proporciona información sobre el tamaño y la cantidad de antígeno (Abbas y col., 2004). El procedimiento de electrotransferencia se inicia apilando sucesivamente una almohadilla empapada de solución de transferencia, posteriormente se coloca el gel, y luego la membrana que contiene los antígenos (proteínas) para que entre en contacto directo con el gel. Finalmente 15

14 otra almohadilla se dispone de forma que el gel quede dirigido hacia el ánodo (+) y la membrana hacia el cátodo (-). La carga neta de las proteínas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa, debido a que el SDS recubre las cadenas polipeptídicas, y por ello pueden migrar hacia el ánodo. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamaño de la proteína (Abbas y col., 2004; ( Figura 3. El procedimiento de inmunodetección consta de cinco pasos; primero se lleva a cabo la transferencia de las proteínas hacia la membrana, luego se prosigue a la saturación de los sitios de la membrana que no hayan sido ocupados por la proteína, para evitar la unión no específica de los anticuerpos, posteriormente se incuba la membrana con el antisuero primario (dirigido contra las proteínas de interés), para luego incubar la membrana con el antisuero secundario unido a una enzima que actúa sobre el sistema y genera como resultado un producto colorido en el lugar donde se encuentran las bandas de las proteínas de interés (Abbas y col., 2004; Ensayo de Manchas (Dot blot) Este método es más sencillo que el ensayo Western blot, consiste en aplicar directamente una pequeña gota de una solución de proteína sobre una membrana similar a la usada en el Western blot. La absorción de la gota provoca la adhesión (adsorción) de la proteína a la membrana, quedando en forma de una mancha (dot), para posteriormente llevar a cabo la inmunodetección usando el esquema descrito en el caso del Western blot. Con este método, pueden estimarse semicuantitativamente concentraciones de proteínas específicas, a partir de preparaciones crudas como los filtrados de cultivo micobacterianos, siempre y cuando se tengan los anticuerpos específicos (Abbas y col., 2004; Figura 4. 16

15 Figura 3. Representación esquemática del ensayo de electrotransferencia e inmunodeteción (Western blot). Fuente: Abbas y col.,

16 Figura 4. Representación esquemática del ensayo de manchas (Dot blot). Fuente: 18