Microscopia y Tinciones

Transcripción

1 Seminario N 2 Microbiología General Microscopia y Tinciones Microscopía Conceptos básicos: NA, resolución, partes del microscopio. Microscopios: campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia, confocal, interferencia, electrónico de barrido, de transmisión, fuerza atómica, efecto tunel Preparación de extendidos. Tinciones: simples, diferenciales, especiales. 1

2 Límite de resolución Antony van Leeuwenhoek 2

3 Descripción de Van Leeuwenhoek de los pequeños animáculos presentes en la placa dental. (First edition, Delft in Holland, 12 September 1683, to Francois Aston, Pag.11). Dibujó bacilos, micrococos y espirilos. 3

4 Apertura numérica Máxima AN (teórica) En objetivos secos: n = 1 y alfa = 90 entonces AN = 1 En la práctica AN = 0.95 (ángulo 72 ) Índice de refracción En objetivos de inmersión: n = 1.51 y alfa = 90 entonces AN = 1.51 En la práctica AN =

5 Apertura numérica Apertura Numérica (AN) = n. sen (alfa) n = índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo (alfa) = mitad del ángulo descripto por el cono de luz que ingresa al objetivo. Uso de un condensador 5

6 Uso de Aceite de inmersión Máximo teórico de AN = 1: α = 90, sin α = 1, n aire = 1 Práctico: AN máx. = 0.95 ángulo de apertura ~ 72 Máximo teórico AN = 1.51: α = 90, sin α = 1, n oil =

7 Poder de Resolución Distancia mínima entre dos puntos para que estos sean vistos como dos objetos individuales R = λ / (NA objetivo + NA condensador) Si luz verde λ = 550 nm, NA = 1.4 (para inmersión) Entonces R =? R = λ /(2 NA) Ocular Cabezal Microscopio óptico Revolver Brazo Objetivos Ajuste de la platina Macrométrico Platina Micrométrico Condensador d Base Fuente de luz 7

8 Distancia de trabajo Diafragma Microscopía de campo claro Campo claro Contraste de fases Campo Oscuro 8

9 Microscopía de campo oscuro La luz reflejada sobre el espécimen entra al objetivo. Entonces observo el espécimen sobre un fondo oscuro. Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) 9

10 Microscopía de contraste de fases Convierte diferencias pequeñas en el n y la densidad celular en variaciones de intensidad de luz fácilmente detectadas. Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) y seguir eventos dinámicos en células vivas (migración, división, etc.) 10

11 Microscopía de Interferencia Diferencial (Nomarski) Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas que atraviesan la célula, para crear una imagen de la estructura celular viva, nítida y tridimensional 11

12 Célula epitelial de mejilla humana Campo Claro Nomarski Campo Oscuro Microscopía de fluorescencia 12

13 Microscopía de fluorescencia Sensibilidad: Mediante fluorocromos permite detectar la presencia de moléculas en baja cantidad (DNA, proteínas) Microscopía Confocal Capacidad de obtener la imagen en secciones (planos) controlando la profundidad del espécimen. Elimina el background! 13

14 Microscopía Confocal vs Microscopía de fluorescencia Fluorescencia Pierde detalle por alta señal de emisión Confocal Las secciones plano por plano permiten evidenciar diferencias en estructuras 14

15 Microscopía electrónica MICROSCOPIO DE LUZ MICROSCOPIO ELECTRONICO Iluminación Haz de luz Haz de electrones Longitud de onda 2000 Å Å 370 nm Lentes Vidrio Electromagnéticas Medio Atmósfera Vacío Resolución 0,2 um = 200 nm 0,0003 um = 0,3 nm Magnificación 10 x x 100 x x Focalización Mecánica Eléctrica 15

16 Microscopio electrónico de transmisión Microscopio electrónico de barrido 16

17 Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Microscopio de túnel de barrido (Tunneling) 17

18 Preparación de extendidos y tinciones Colorantes Benzeno + Cromoforo Solvente orgánico sin color Grupo químico que imparte Color al solvente Cromógeno + Grupo químico que permite la iniciación Auxocromo del cromóforo permitiendo la formación de sales y la unión a fibras y tejidos Colorante 18

19 Tinción Simple Se utiliza para la visualización de la morfología, el tamaño y la disposición Tipos de tinciones Tinción Diferencial Separa entre grupos Visualización de estructuras Gram Ácido alcohol resistentes Flagelos Cápsula Esporas 19

20 Preparación de un extendido Tinción simple (procedimiento) 20

21 Tinción negativa (procedimiento) 21

22 Tinción de Gram 22

23 Tinción de Gram Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) 23

24 24

25 Tinción de Esporas (Schaeffer-Fulton) Tinción de Esporas (Dorner) Tinción de Cápsula 25

26 Manipulación de cultivos 26