TEMA 9 MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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1 TEMA 9 MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

2 INDICE DE CONTENIDOS Introducción Tipos de microscopía óptica Microscopía de campo claro Microscopía de campo oscuro Microscopía de contraste de fases Microscopía de fluorescencia Examen microscópico de material fresco Examen microscópico de material fresco levemente modificado Hidróxido de potasio al 10 % Tinta china (marca Pelikan) o nigrosina Lugol Anticuerpos Microscopía óptica Tinción de gram Tinción ácido alcohol resistente Microscopía de fluorescencia. Fundamento Colorantes para la microscopía de fluorescencia y aplicaciones Auramina-Rodamina Naranja de acridina Blanco de calcofúor Isotiocianato de fluoresceína Inmunofluorescencia Microscopía electrónica Barrido Transmisión

3 TIPOS DE MICROSCOPÍA MICROSCOPÍA ÓPTICA MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA INMUNOFLUORESCENCIA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA TRANSMISIÓN BARRIDO

4 TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE MUESTRAS SIN TEÑIR MONTAJE DIRECTO OBSERVACIÓN DE MOVILIDAD OBSERVACIÓN DE ESPIROQUETAS OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado) TÉCNICA DE LA GOTA PENDIENTE MOVILIDAD OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado)

5 OBSERVACIÓN DE Treponema pallidum EN CAMPO OSCURO O CONTRASTE DE FASES

6 PREPARACIONES LEVEMENTE MODIFICADAS MONTAJE EN KOH 10% AZUL DE LACTOFENOL PARA OBSERVACIÓN DE HONGOS TINTA CHINA O NIGROSINA OBSERVACIÓN DE HONGOS MONTAJE EN YODO (LUGOL) OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS REACCIÓN DE NEUFELD QUELLUNG PARA DETECCIÓN DE Streptococcus pneumoniae Y Haemophilus influenzae tipo b capsulado

7 Observación de hongos

8 Observación de huevos y parásitos

9 MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO. OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES TEÑIDAS Tinción de Gram Gram positivos y Gram negativos Morfología Agrupaciones

10 Ejemplos de bacterias y levaduras teñidas Cocos gram positivos en extendidos directos de pus

11 Ejemplos de bacterias gram positivas y gram negativas

12 OBSERVACIÓN DE BAAR EN EXTENDIDOS DIRECTOS Tinción ácido alcohol resistente: Método en caliente (Ziehl-Nielsen) Método en frío (Kinyoun) Micobacterias, Nocardia, algunos Micobacterias, Nocardia, algunos hongos como Cryptococcus neoformans

13 PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

14 Principales fluorocromos utilizados Naranja de acridina Auramina-Rodamina Blanco de calcoflúor Isotiocianato de fluoresceína colorante vital micobacterias hongos (inmunofluorescencia)

15 COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA FLUORESCENTE CON LA TINCIÓN DE GRAM

16 COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE FLUORESCENCIA Y ÁCIDO- ALCOHOL RESISTENCIA PARA LA DETECCIÓN DE MICOBACTERIAS

17 Ventajas de la fluorescencia Ventajas de la fluorescencia Mayor sensibilidad Microscopio 25x ó 40x Especificidad en la tinción de auraminarodamina Naranja de acridina colorante vital (permite ver si son viables)

18 PRINCIPIO DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

19 DETECCIÓN DE LEGIONELLA Y BORDETELLA MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA

20 DETECCIÓN DE YERSINIA PESTIS Detección de Yersinia pestis mediante inmunofluorescencia

21 DETECCIÓN DE VIRUS POR INMUNOFLUORESCENCIA Detección de CMV mediante inmunofluorescencia directa

22 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA MICROSCOPÍA ÓPTICA HAZ DE LUZ LENTES MUESTRAS INTACTAS O FIJADAS AMPLIFICACIÓN 1000X MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA HAZ DE ELECTRONES CAMPOS MAGNÉTICOS TRANSMISIÓN BARRIDO MUESTRAS FIJADAS E INCLUIDAS EN RESINA CORTES ULTRAFINOS (TRANSMISIÓN) AMPLIFICACIÓN X MUESTRAS FIJADAS SOBRE UNA SUPERFICIE BARRIDO DEL HAZ SOBRE LA SUPERFICIE AMPLIFICACIÓN X

23 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

24 DETECCIÓN DE PARTÍCULAS DE VIRUS POR MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

25 USOS MÁS FRECUENTES DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA GRUPO DE MICROORGANISMO MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA BACTERIAS + + +/- - HONGOS PARÁSITOS VIRUS

26 CARACTERÍSTICAS CLAVE DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Microscopia óptica Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones Campo claro El contraste se logra por absorción. Imagen clara. Las muestras requieren tinción. Para observar organismos completos. Contraste de fases El contraste se consigue por interferencia; las diferencias en el indice de refracción cambian la fase de la luz Imágenes claras y detalladas rodeadas de un balo. No requiere tinción; se pueden observar preparaciones en fresco de células vivas. Movilidad Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la muestra entra en el objetivo, produciéndose un contraste elevado. Imagen brillante contra un fondo oscuro. Para observar células vivas o flagelos demasiado finos para la microscopia de contraste de fases; pocos detalles internos. Movilidad. Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir luz visible que tienen los especimenes fluorescentes cuando se les ilumina con luz uv. Especimenes muy coloreados (luminosos) contra un fondo oscuro. Utilizando anticuerpos fluorescentes se pueden identificar tipos especificos de microorganismos en una mezcla compleja. Microscopía electrónica Transmisión (MET) Hace pasar un haz de electrones a través de la preparación, produciendo un gran aumento útil Imágenes muy ampliadas con gran detalle. Para observar virus y la ultraestructura celular. No se pueden observar organismos vivos porque las preparaciones ban de ser totalmente desecadas. Barrido (MEB) Barre los especimenes con un chorro de electrones, produciendo la salida de electrones secundarios que crean una señal, que, a su vez, genera una imagen por ordenador. Imagen tridimensional. Para ver estructuras de organismos intactos, e incluso estructuras internas con detalles reales. Las muestras han de ser desecadas, por tanto, no se puede aplicar a organismos vivos