- Que el alumno pueda utilizar el microscopio para la observación de preparados coloreados

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1 2017

2 TRABAJO PRACTICO N 2: MICROSCOPIA Y TINCIONES OBJETIVOS: - Que el alumno pueda utilizar el microscopio para la observación de preparados coloreados - Que el alumno conozca y pueda efectuar las tinciones de Gram y Zielh Neelsen INTRODUCCIÓN: Las tinciones son técnicas necesarias para poder observar a los microorganismos que por su tamaño no pueden ser observados a simple vista o es dificultoso visualizarlas en muestras frescas. Existen diferentes tinciones que se usan para observar diferentes partes de las estructuras de las células procariotas, dos de las más utilizadas en microbiología clínica son la TINCIÓN DE GRAM en donde se pone en manifiesto el tipo de pared celular mediante lo cual se dividen a las bacterias en dos grandes grupos Gram positivas y las Gram negativas y la TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN para la observación de bacilo ácido alcohol resistentes (ej. Bacilo de Koch, etc) El microscopio es de suma importancia en el desarrollo de nuestra actividad profesional y en especial en el área bacteriológica. Existen diversos tipos de microscopíos, la elección de uso depende de la aplicación que se quiera conseguir: de microscopio simple, compuesto, de fluerescencia, de luz ultravioleta, de campo oscuro, de contraste de fases, electronico de transmisión, electronico de barrido. El mas freceunte y utilzado en los laboratorios de bacteriología son los microscopios somples. Fig 1. Fig 1. Esquema de un microscopio. Se puede observa el recorrido de la luz. Tomado de opia.htm

3 EL MICROSCOPIO Y SUS PARTES: El microscopio es una herramienta extremadamente útil en el laboratorio, el mismo cuenta con: Oculares: lentes que amplian la imagen captada por el objetivo Objetivos: lentes con proximidad a la muestra que amplia su imagen Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre el preparado Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador Platina: lugar donde se deposita Cabezal: es el soporte para los lentes oculares ( uni o binoculares) Revólver: es un soporte que contiene los objetivos los cuales se pueden girar para lograr posicionar el necesario Tornillos del enfoque: macro y micrométrico para lograr el ajuste del enfoque o la nitidez de la imagen UTILIZACION DEL MICROSCOPIO: Si necesitamos la observación de una muestra en fresco utilizamos los objetivos de bajo poder 5X, 10X, ó 40X, y se coloca sobre la platina baja el portaobjeto con la muestra cubierta con el cubreojeto, se baja el condensador y se sube la platina para finalmente usar el tornillo micrómetro para conseguir visualizar con nitidez Si tenemos que observar una muestra fija o con tinciones lo hacemos utilizando el objetivo de 100X y colocar una gota de aceite de inmersión sobre el preparado y se eleva el condensador y se abre completamente el diafragma y así se comienza a bajar la platina para enfocar. EL MICROSCOPIO DEBE SER UTILIZADO EN FORMA RESPONSABLE Y CUIDADOSA, después de su uso, para deberán limpiarse los objetivos con una gasa embebida en alcohol 70 o con xilol, que será facilitado por la cátedra. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES: Si no esta utilizando el microscopio, el mismo debe estar desenchufado, cubierto con la funda plástica con el fin de evitar que se ensucien y dañen los lentes.

4 No se deben tocar nunca las lentes con las manos. Ni utilizar maquillaje en los ojos que ensucien los lentes, en caso de necesidad límpielas suavemente con pañuelos especiales para óptica. Nunca deje el preparado sobre la platina cuando no este utilizando el microscopio. Preparación de una muestra en fresco: Se hace una observación de una muestra húmeda una gota entre porta y cubreobjetos, esto es un valioso aporte para observar la presencia de reacción inflamatoria, parásitos, levaduras (con o sin pseudomicelios), Fig 2. Cubreobjeto Fig 2. Preparación de un preparado fresco. PREPARACIONES FIJAS ( CON TINCIONES) Se deposita una gota de agua destilada estéril o solución salina estéril y se coloca una colonia del cultivo o una gota de la muestra si fuese líquida directamente sobre un portaobjetos y con el ansa se diseminan hasta formar una delgada y homogénea película se fija flameando sobre la llama del mechero (la fijación del preparado puede también hacerse con metanol) para una vez seca proceder a teñir con los colorantes necesarios según sea la muestra y el objetivo de su observación por ejemplo si es una muestra de cultivo de flujo vaginal se hace una coloración de Gram y Giemsa, si son Mycobacterias se realiza una coloración de Ziehl Neelsen. Fig 3.

5 Fig. 3. Preparación de un frotis bacteriano. Tomado de Diaz, Garmazo y Lopez Goñi COLORACION DE GRAM: 1.-En portaobjeto perfectamente limpio y desengrasado preparar un extendido fino y dejarlo secar al aire. 2.- Fijar el material pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama, para evitar que sea arrastrado por agua de lavado. 3.- Colorear el portaobjeto sobre las varillas de la cubeta de coloración y cubrir con solución de cristal violeta 1 minuto (según la calidad del colorante se pueden acortar los tiempos). Fig Lavar cuidadosamente con abundante agua. 5.- Cubrir con solución de iodo durante 1 minuto. 6.- Lavar con agua. 7.- Decolorar durante 20 segundos exactamente con solución de alcohol-acetona. 8.- Lavar con agua. 9.- Cubrir con solución contracolorante de safranina durante 1 minuto Lavar con agua. Colocar en posición vertical hasta que se seque 11.- Observar con objetivo de 100 X de inmersión.

6 Fig. 4 Pasos de la tinsión de Gram. Tomado de Diaz, Garmazo y Lopez Goñi Tinción de Ziehl Neelsen Todas las bacterias se tiñen con el colorante fucsina en presencia de calor. Sin embargo, la mayoría de las bacterias se decoloran después del tratamiento con etanol/hcl, excepto las micobacterias y géneros relacionados que resisten al tratamiento decolorante y retienen al colorante. Esta ácido alcohol resistencia se debe al alto contenido de sustancias hidrofóbicas (ácidos micólicos) en la pared celular. Técnica de Coloración: 1. Efectuar un extendido fino sobre un portaobjeto limpio y perfectamente desengrasado. 2. Cubrir con colorante carbofucsina y calentar con hisopo hasta desprendimiento de vapores. Efectuar este calentamiento tres veces en el término de minutos, cuidando que no entre en ebullición. 3. Esperar que se enfríe, volcar el colorante, lavar con agua e inclinarlo haciendo escurrir un poco de Solución decolorante, cubrir con la misma Solución de 1 a 2 minutos, lavar. 4. Lavar y colorear con azul de metileno (contracolorante) de 30 a 60 segundos. De esta técnica se verán preparados de esputos positivos en donde se deberá observar los bacilos ácidos alcohol - resistentes. OTRAS COLORACIONES Y SUS APLICACIONES:

7 Tinciones y métodos microscópicos para la detección rápida de microorganismos en muestras y materiales infectados Tinción y método Wright- Giemsa Azul de metileno Gram Ziehl- Neelsen, Kinyoun Microsco pía de campo oscuro Aplicación Resultados esperados Comentarios LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo Gránulos metacromáticos de corinebacterias Permite hacer diagnóstico presuntivo, sobretodo, en neumonía y meningitis bacteriana Tinciones de muestras (esputos, LBA, LCR, orina, etc.) para identificar bacterias ácidoalcohol resistentes (AAR) y para diferenciación de Micobacterias y algunos actinomicetalesa erobios (AAR parcial) Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria Morfología general de las estructuras celulares Morfología general y seleccionada Detección de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes Los microorganismos AAR muestran un color rojo granate, contrastado sobre un fondo azulado, permite detectar también parásitos como Cryptosporidum y Cyclospora Se ven espiroquetas móviles Permite visualizar bacterias, levadura, parásitos y inclusiones virales Corynebacterium diphteriae Requiere experiencia para valoración adecuada no incluye otros agentes infecciosos pero puede diferenciar levaduras Las Micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias, bacilos arboriformes y ramificados Requiere experiencia Tinta china KOH 10% Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Cryptococcus Examen directo de las extensiones de piel, pelos y Los criptococos poseen una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro Visualiza elementos fúngicos Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización.

8 Naranja de acridina Blanco calcofluo r uñas para ver dermatofitos Es eficaz para diferenciar verdaderos microorganismo s de artefactos, especialmente en hemocultivos Examen directo de LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios Tinción de fluorocromo fijada a los núcleos de las bacterias, que muestran fluorescencia naranja sobre un fondo oscuro, fluorescen tanto bacterias viables como no viables Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave Requiere el uso de microscopia de fluorescencia Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias, se prefiere a la tinta china y a preparaciones de KOH Requiere el uso de microscopio de fluoroescencia Recordar que: Los colorantes son para los portaobjetos. NO SON PARA LAS MANOS. NO SE DESPERDICIAN, NO SE TIRAN. Hay que trabajar pensando en que se esta haciendo. Bibiolgrafía Díaz R Gamazo C y López Goñi I Manual práctico de microbiología. Edición Masson