6. Fundamentos de la microscopía confocal espectral

Transcripción

1 6. Fundamentos de la microscopía confocal espectral

2 Microscopio confocal

3 Microscopio confocal

4 La distinción fundamental entre la microscopía óptica convencional y la microscopía óptica confocal es la manera en la cual se produce la imagen.

5 Microscopía óptica convencional Interacción de la radiación con la muestra en una región extensa. Imágenes degradadas por toda la información óptica que se origina en esa extensa iluminación, así como por la información óptica contenida en planos que no son el plano enfocado.

6 Microscopía óptica confocal Se producen punto a punto en el plano imagen a partir de los correspondientes puntos de iluminación del plano de la muestra. La fuente de iluminación puntual ilumina una región del objeto y el detector puntual recibe la radiación de esta área objeto. La imagen se construye por el barrido sincronizado de la fuente y el detector.

7 Microscopía óptica confocal El principio de confocalidad: Luz láser Diafragma (PINHOLE) Divisor del haz Detector Objetivo Muestra

8 Microscopía óptica confocal La calidad de las imágenes resultantes se debe a la omisión de toda la información óptica fuera de foco que degrada convencional. la imagen en la microscopía

9 Microscopía óptica confocal El principio de confocalidad: El pinhole está conjugado con el punto focal de las lentes por eso es un pinhole confocal.

10 Microscopía óptica confocal Luz láser Diafragma (PINHOLE) Divisor del haz Detector Objetivo Muestra

11 Microscopía óptica confocal La microscopía confocal permite obtener secciones ópticas en profundidad que generan imágenes tridimensionales de la morfología de una muestra. Microscopía confocal Microscopía convencional

12 Instrumentación Secciones ópticas: Luz láser Objetivo Muestra

13 Microscopía óptica confocal Una imagen confocal es una sección óptica de una muestra. Tomando distintas imágenes confocales se obtiene una imagen tridimensional en foco. Esta capacidad es útil para medir perfiles de superficie y cuando se acopla con la fluorescencia da una representación tridimensional morfología interna de la muestra. de la

14 Microscopía óptica confocal Células

15 Microscopía óptica confocal Reconstrucción Células

16 Microscopía óptica confocal Series Drosofila

17 Microscopía óptica confocal Proyección máxima Drosofila

18 Microscopía óptica confocal Reconstrucción Drosofila

19 Microscopía óptica confocal Reconstrucción Convalaria

20 Cómo funciona un microscopio confocal? láser espejos de barrido espejo dicroico microscopio muestra pinhole detector

21 Cómo funciona un microscopio confocal? láser espejos de barrido espejo dicroico microscopio muestra pinhole detector

22 Cómo funciona un microscopio confocal? láser espejos de barrido espejo dicroico microscopio muestra pinhole detector

23 Cómo funciona un microscopio confocal? La imagen se forma punto a punto y sección a sección.

24 Microscopio confocal ESPECTRAL Filtro barrera Filtro de excitación Espejo dicroico Muestra

25 Microscopio confocal ESPECTRAL Fluoresceína

26 Microscopio confocal ESPECTRAL

27 Microscopio confocal ESPECTRAL Fluoresceína Rodamina

28 Microscopio confocal ESPECTRAL Fluoresceína Rodamina

29 Microscopio confocal ESPECTRAL La luz emitida por la muestra se separa en bandas espectrales de modo que se pueda recoger el rango o rangos de longitud de onda que interese.

30 Microscopio confocal ESPECTRAL Detectores Rendijas

31 Microscopio confocal ESPECTRAL Prisma Rendija Detector

32 Microscopio confocal ESPECTRAL El sistema de detección espectral ofrece la posibilidad de seleccionar libremente las bandas de detección y aumenta la captación de luz en un % frente a sistemas de detección basados en filtros ópticos. Esto supone una mayor relación señal/ruido, una mejor calidad de imagen, menor blanqueado y mayor viabilidad de muestras vivas ya que se requiere menor potencia de láser, y mayor poder de penetración en muestras con mucha dispersión de luz.

33 Microscopio confocal ESPECTRAL El resultado es un sistema de detección multibanda que permite ajustar individualmente las bandas de emisión aumentando la calidad y reduciendo el cruzamiento. Es un espectrómetro que permite hacer barridos a diferentes longitudes de onda. La longitud de onda puede ser adaptada a las características reales de emisión de la muestra. Fácilmente adaptable a nuevos fluorocromos.

34 Preparación de la muestra La mayoría de los protocolos de microscopía confocal se basan en los desarrollados para la preparación de muestras en microscopía óptica convencional. Un buen punto de comienzo para el desarrollo de un nuevo protocolo es preparar la muestra para la microscopía óptica convencional e ir modificándolo para el confocal según sea necesario.

35 Preparación de la muestra El sistema confocal recoge menos fluorescencia de una muestra gruesa comparado con el microscopio convencional por lo que las muestras requerirán tiempos de tinción mayores o bien mayores concentraciones, y en el microscopio convencional pueden aparecer sobreteñidas.

36 Preparación de la muestra Muchos protocolos incluyen un antiblanqueante que protege el fluoroforo de los efectos de blanqueo del láser. Es aconsejable utilizar la menor potencia de láser que sea práctica y así se protege el fluorocromo.

37 Preparación de la muestra Se deben tomar medidas para preservar la estructura tridimensional de las muestras utilizando algún tipo de espaciador entre el porta y el cubre. Cuando las muestras vivas están sujetas a estudio, generalmente es necesario montarlas en una cámara que provea todo lo necesario para la vida.

38 Preparación de la muestra Las propiedades de la muestra tales como opacidad o turbidez pueden influir en la profundidad que es capaz de alcanzar el láser dentro de la muestra. Muchos protocolos incorporan algún agente aclarante que aumenta la transparencia de la muestra.

39 Preparación de la muestra Fijación: Buena preservación de la muestra y del anfígeno Sin añadir fluorescencia Fijadores: Metanol Aldehídos: Paraformaldehído 4% Formaldehído 3,9% = Formalina 10% Glutaraldehído Especiales: PLP (paraformaldehído, lisina, periodato)

40 Preparación de la muestra Marcaje: Específico e intenso Sin cruzamiento Mínimo photobleaching

41 Preparación de la muestra Marcaje: 1. Autofluorescente 2. Tinciones fluorescentes Tinciones generales: naranja de acridina, eosina Tinciones específicas: (Molecular Probes) nucleo: DAPI, Hoechst, Ioduro propidio, Sytox mitocondrias: mitotracker lípidos: nile red filamentos de actina: faloidina

42 Preparación de la muestra Montaje: Medio: Índice de refracción: glicerol Antifading Inhibidor de la contaminación: Azida sódica Cubreobjetos: 0,17 mm plano, regular Montaje sin apretar pero sin espacio entre muestra y cubre.