Microscopio óptico. Aumento total = aumento objetivo x aumento ocular. Ocular Capta y amplía la imagen formada en el objetivo

Transcripción

1 Microscopía óptica

2 El microscopio

3 Microscopio óptico Ocular Capta y amplía la imagen formada en el objetivo Objetivo Sistema de lentes delgadas: proyecta una imagen real, aumentada e invertida de la muestra Diafragma Regula cuanta luz llega al condensador Condensador Concentra los rayos luminosos sobre la preparación Fuente de luz Ilumina la muestra Aumento total = aumento objetivo x aumento ocular

4 Microscopio invertido

5 Objetivos Aumento Cuanto se va a ampliar la imagen luego de pasar por el objetivo (10x,60x, 100x) Apertura numérica Medida de la capacidad del objetivo para recoger la luz y resolver detalles finos de la muestra Objetivo de Inmersión Los objetivos pueden ser clasificados en secos o de inmersión Espesor del cubreobjetos

6 Apertura numérica AN = n. sen (α) n = índice de refracción Es una medida de cuanto disminuye la velocidad de una onda al atravesar dicho medio α = ½ ángulo de apertura n = 1 Aire n = 1.33 Agua n = Aceite/vidrio Índice de refracción del aire < Índice de refracción del aceite AN (objetivo seco) < AN (objetivo de inmersión)

7 Qué ocurre cuando utilizamos aceite de inmersión? Aire: debido a la refracción, gran parte de la luz no llega al objetivo Con aceite: índice de refracción uniforme, la luz no cambia de ángulo. Mucha mas luz llega al objetivo

8 Resolución La resolución (R) de un objetivo es la menor distancia entre dos puntos del espécimen que pueden distinguirse como dos entidades separadas d < R d d > R Muestra Imagen Apertura numérica A mayor apertura numérica mejor resolución Longitud de Onda A menor longitud de onda mejor resolución Cuanto menor es R, mejor la resolución

9 Intensidad o brillo Intensidad = (Apertura numérica) 4 (Magnificación) 2 Por ejemplo: 10x AN = 0,25 40x AN = 0,6 (0,25) 4 = 3,9 x 10-5 (0,6)4 = 8,1 x 10-5 (10) 2 (40) 2

10 Tipos de microscopía Campo claro El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de la muestra o es reflejada del espécimen. Las muestras deben ser delgadas. Muchas veces se usan tinciones diferenciales. Células MDCK (línea células epiteliales)

11 Tipos de microscopía Contraste de Fases Se basa en el retraso de las ondas de luz al atravesar objetos de distintos índices de refracción (densidades), aprovechando y amplificando dichos retrasos. Las regiones mas densas se ven mas oscuras que el fondo Células MDCK

12 Tipos de microscopía Campo Claro Contraste de Fases No hay buen contraste con el fondo No se observan límites claros No se distinguen estructuras internas Buen contraste de células con el fondo Límites celulares evidentes (oscuros) Se distinguen estructuras internas

13 Tipos de microscopía DIC (Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial) Utiliza luz polarizada y prismas para exagerar los gradientes de índices de refracción dentro de una muestra. Las bicapas lipídicas producen un buen contraste en DIC por la diferencia de índice de refracción entre el medio lipídico y el medio acuoso de la célula Glóbulos rojos Células HeLa

14 Qué objetivo usar? Queremos ver muchas células en un mismo campo o detalles en una célula? Magnificación: 10x, 40x, 100x Para una misma magnificación Qué apertura numérica elegir? Cuanto mayor es AN, mejor es la resolución Campo claro, contraste de fase, DIC? Depende las posibilidades de cada objetivo/microscopio

15 Tipos de microscopía Microscopía de Fluorescencia Se basa en la detección de proteínas o estructuras marcadas o que son intrínsecamente fluorescentes. Qué ventajas introduce la microscopía de fluorescencia? - Especificidad - Contraste - In vivo - Desde microorganismos a mamíferos En el TP -Expresión de proteínas de fusión fluorescente (GFP o mcherry) -Anticuerpos o toxinas conjugados a fluorocromos -DAPI (tiñe ADN)

16 Fuente de Iluminación Para excitar la fluorescencia de un fluorocromo se necesita una fuente de luz intensa que suministre las longitudes de excitación del fluorocromo en uso. -Lámpara de Mercurio -Diodo emisor de luz (LED) -Láseres (para microscopia de confocal)

17 CUBO DE FILTROS DE FLUORESCENCIA Filtro de emisión: Determina que rangos de longitudes de onda llegan al detector Detector Deja pasar luz entre nm Espejo dicroico: Refleja luz de λ baja Transmite luz de λ alta λ=510 nm Objetivo Fuente de iluminación Filtro de excitación: Determina que rango de longitud de onda va a incidir en la muestra Deja pasar luz entre nm

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19 Tipos de microscopía de fluorescencia Campo amplio vs confocal: La configuración del microscopio confocal permite iluminar un volumen menor. Solo llega al detector la luz emitida en el plano que está en foco.

20 Microscopía de fluorescencia confocal Al eliminar la fluorescencia proveniente de planos fuera de foco se pueden ver más detalles en la muestra

21 Microscopía de fluorescencia confocal Se puede realizar una serie de secciones ópticas en el eje z Se pueden realizar representaciones en 3D Podemos determinar si la localización de dos proteínas coincide dentro de una sección óptica COLOCALIZACIÓN

22 Cámaras: CCD (Charged Coupled Device) Las cámaras CCD capturan la luz y la convierten en data digital. La resolución de una cámara depende del tamaño y número de pixeles del chip

23 Cómo pasamos de intensidad de luz a data digital?

24 Profundidad de bits Un bit es la unidad mínima de capacidad de información que utiliza una computadora El número de niveles en la escala de gris (profundidad de bits) está determinado por la cantidad de bits Niveles = 2 n bits Ejemplo: si un pixel de una imagen bitmap tiene 8 bits de profundidad de color, entonces podrá tomar hasta 256 colores 2 8 = 256 MÁS BITS NOS PERMITEN DETECTAR MAS DETALLES

25 Para consultar: campus.magnet.fsu.edu/

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