DECONVOLUCIÓN criterio de Nyquist

Transcripción

1 DECONVOLUCIÓN La deconvolución surgió como alternativa al confocal, con ella se pretendía eliminar la luz fuera de foco de imágenes tomadas con una cámara digital o en fluorescencia convencional, pero poco a poco ha ido avanzando y se ha adaptado para mejorar imágenes tomadas también en un confocal. El proceso de deconvolución depura las imágenes, utilizando una serie de cortes de la muestra el programa reconoce la luz fuera de foco a través del psf, proporcionándonos una imagen más limpia y con más detalle. En definitiva, el proceso de deconvolución consigue mostrarnos lo que el sistema óptico no llega a ver, siendo capaz de separar estructuras que antes no éramos capaces de diferenciar. Para hacer deconvolución hay que tener en cuenta dos factores: - El criterio de Nyquist - El psf (Point Spread Function) Si algún factor fallase, la deconvolución de nuestra imagen no sería la óptima. El criterio de Nyquist determina la densidad mínima de la muestra necesaria para capturar toda la información de la imagen desde el microscopio. Lo que necesita es una información mínima por píxel, para poder tener la mayor cantidad de datos a la hora de procesar la imagen.

2 Si nuestra imagen no cumple el criterio de Nyquist, la resolución y la información con la que tiene que trabajar el software estarán por debajo de lo necesario, produciéndose un procesamiento más lento y un resultado de peor calidad. El psf es el límite de resolución que tiene el equipo donde se han tomado las imágenes. Para saber este límite se toman secciones de imágenes que están por debajo del límite de resolución, que es 0.2 μm, y de estos cortes se consigue la información necesaria para construir el psf. psf en eje xy Estas imágenes contienen información sobre el índice de difracción y posibles errores en nuestro equipo. A partir de esta información se calcula el psf con los limites de resolución de nuestro equipo, de manera que cuando se haga el proceso de deconvolución lo que se intentará será eliminar los ordenes de difracción que quedan por fuera del punto central al igual que se intenta deshacer de los halos que se encuentran alrededor de éste. psf en el eje xy psf en el eje xz

3 Si no se pudiesen tomar estos cortes de imágenes por debajo del nivel de resolución, el propio programa tiene una opción para calcular directamente el psf, lo que llama psf teórico. En ese proceso el software calcula el psf a partir de la imagen que posteriormente queremos tratar en deconvolución. En definitiva, la deconvolución lo que intenta es eliminar los órdenes de difracción y dejar tan sólo el punto central, eliminando así la luz fuera de foco. Si no tenemos un buen psf el software no tendrá la información suficiente para diferenciar entre pixels que se corresponden con luz fuera de foco o no, produciéndose una imagen de deconvolución que apenas mejorará la original. Para trabajar con estos programas se necesitan aparatos informáticos de gran potencia ya que son programas que continuamente están haciendo cálculos y necesitan mover información a velocidades muy altas, estos software normalmente se encuentran en ordenadores compuestos por más de un procesador y con un tamaño de memoria bastante elevado.

4 HUYGENS PROCESO DE DECONVOLUCIÓN Hay que fijarse en la tabla de información y cálculos necesarios para realizar correctamente la deconvolución. De esta tabla obtendremos los valores necesarios para hacer bien la deconvolución dependiendo del objetivo que tengamos y el fluoróforo que estemos utilizando, como hay bastante diferencia entre un fluoróforo y otro, lo óptimo sería hacer la deconvolución de los canales por separado y una vez hecha la deconvolución mezclar los canales. Dentro de esta tabla nos tendremos que fijar dependiendo de si vamos a tomar imágenes en confocal o en una cámara ccd, en: Excitation: mide en nm la longitud de onda de excitación que tiene el fluoróforo. Emission: mide en nm la longitud de onda, en este caso la de emisión (siempre mayor que la de excitación). Pinhole (Airy units): parámetro de los confocales Zeiss, valor de Airy units para conseguir un iris o pinhole óptimo. Backprojected pinhole: este valor solo es para confocal y las imágenes del META ya llevan el valor si se han guardado en formato.lsm dependiendo de la apertura del pinhole o iris.

5 Tamaño Píxel: también en nm, es el tamaño que debemos conseguir en nuestra imagen a través del zoom en el confocal. Ojo!! en el confocal nos dará el valor en μm También podemos intentar conseguir esos tamaños de píxel utilizando la máxima resolución 2048x2048, para que de esta manera no se tenga que hacer tanto zoom. Secciones Confocal: valor que nos da en nm y que tenemos que tener en cuenta a la hora de tomar secciones, ya que se refiere a la distancia step entre secciones. El confocal normalmente da el valor en μm. Una vez que hayamos tomado las imágenes con los parámetros necesarios podemos empezar el proceso de deconvolución. HUYGENS Para entrar al programa tendremos que entrar en el sistema operativo Linux y con la cuenta de usuarios. Una vez dentro abrimos el programa que aparece en el escritorio con el siguiente símbolo: MANEJO PROGRAMA Al entrar en el programa, lo primero es abrir las imágenes que queremos procesar, utilizando el menú File/ Open:

6 Una vez abierta la imagen Seleccionar la imagen y con el botón derecho del ratón nos saldrá un menú. Para introducir los parámetros de la imagen. Si hemos tomado las imágenes en el confocal Zeiss, reconoce bien los parámetros, el único valor a modificar sería el Refractive indexes: Medium, mirar la tabla de indices de refraccion: Para visualizar la imagen. Para realizar de deconvolucion y calculos de PSFs.