8. Instrumentación del microscopio confocal espectral

Transcripción

1 8. Instrumentación del microscopio confocal espectral

2 Parámetros importantes del microscopio confocal: Fuente de iluminación: Láser Pinhole Detector: Fotomultiplicador! Microscopio óptico

3 Microscopio óptico La primera visualización de la muestra se hace con el microscopio óptico: 1) Seleccionar el área de interés 2) Seleccionar los aumentos adecuados 3) Enfocar 4) Ajustar la iluminación de Köhler 5) Pasar al modo confocal

4 Microscopio confocal Sistema de láseres

5 Microscopio confocal Fuente de iluminación: LÁSER Propiedades: Elevado grado de monocromatismo Divergencia pequeña Brillo elevado Elevado grado temporal de coherencia espacial y

6 Láser Láseres de onda continua: láser de gas Ión de argon (Ar): 458 nm 476 nm 488 nm 514 nm Helio-neon (He/Ne)-Verde: 543 nm Helio-neon (He/Ne)-Rojo: 633 nm Diodo UV: 405 nm

7 Láser 405 UV Ar Ar 458 Ar Ar He/Ne verde 633 He/Ne rojo

8 Láser Configuración predeterminada

9 Láser Elección del láser

10 Láser Potencia: 50 % A mayor potencia, mayor intensidad de la señal, pero mayor fotoblanqueado del fluorocromo.

11 Pinhole Los microscopios de barrido confocal son particularmente atractivos en virtud a su resolución lateral aumentada y el seccionado óptico. La última propiedad es la más útil y da lugar a la posibilidad de obtener imágenes de muestras gruesas en tres dimensiones.

12 Pinhole Esto es posible porque el sistema óptico detecta información sólo de una región delgada en la vecindad del plano focal lo que permite almacenar muchas secciones de imágenes en un ordenador para obtener un conjunto de datos tridimensionales que describan al objeto. Hoy en día existen muchos sistemas de software que muestran estos datos de muchas maneras.

13 Pinhole La única diferencia entre un microscopio de barrido confocal y un microscopio de barrido convencional es que el confocal utiliza un detector puntual en lugar de un área grande. Todas las considerables ventajas de la microscopía confocal derivan del pequeño tamaño de este detector, el PINHOLE.

14 Pinhole El éxito o fracaso en alcanzar una verdadera operación de microscopía confocal depende de la correcta elección de la forma y tamaño del pinhole que se aproxime tanto como sea posible a las del detector puntual ideal.

15 Microscopio confocal

16 Pinhole El pinhole está presente para evitar que llegue al detector luz que se origina en un plano que no sea el plano de foco. Se monta en un plano imagen y si su tamaño se reduce más de lo que corresponde a un spot limitado por la difracción en la muestra, entonces reducirá severamente el número de fotones que alcanzan el detector mientras que se producirá sólo una mejora marginal en la resolución xy o z.

17 Pinhole Haciendo el pinhole mayor que el spot limitado por difracción permite que se detecten más fotones pero como casi todos los que se originan en el plano de foco ya se recogen, la mayoría de la señal adicional viene de planos adyacentes, reduciendo la resolución z.

18 Pinhole Luz láser Diafragma (PINHOLE) Divisor del haz Detector Objetivo Muestra

19 Pinhole El valor óptimo del pinhole es el que corresponde a Airy 1.

20 Pinhole Patrón de difracción de Airy: La imagen de un punto de luz tiene un tamaño finito y una forma característica determinada por los efectos de difracción del llamado Patrón de difracción de Airy. Es un patrón con un disco central muy intenso rodeado de una serie de pequeños anillos de difracción.

21 Pinhole Disco de Airy: Disco de Airy

22 Pinhole En la microscopía confocal el tamaño del pinhole debe ser el mismo que el del disco de Airy porque de este modo se permite el paso de la mayor cantidad de luz (95 %) condiciones de confocalidad. manteniendo las

23 Pinhole El diámetro del disco de Airy es aproximadamente igual a 1,22 veces la longitud de onda dividido por la apertura numérica del objetivo: diámetro = 1,22 λ / A.N. Depende por tanto del objetivo que se esté usando. d

24 Pinhole El criterio de Rayleigh para la resolución: Dos puntos se pueden resolver, cuando sus discos de Airy están separados. La mínima distancia resoluble entre dos puntos se da cuando el máximo de uno de los patrones de difracción de Airy coincide con el primer mínimo del otro, es decir, cuando la distancia centro a centro entre los máximos es mayor que la anchura de los máximos.

25 Pinhole El criterio de Rayleigh para la resolución: Resueltos Límite de resolución No resuelto

26 Pinhole El criterio de Rayleigh para la resolución: La mínima distancia resoluble entre dos puntos corresponde al radio de un disco de Airy: diámetro = 1,22 λ / A.N. radio = 0,61 λ / A.N. El valor óptimo del pinhole es el de Airy 1

27 Detector El sistema de detección del microscopio separa la señal emitida por la muestra en bandas: sistema espectral. Recoge la señal fotomultiplicadores (PMT). mediante detectores

28 Detector

29 Detector Fotomultiplicador: Un dispositivo que convierte la energía de la luz incidente en fotoelectrones emitidos al vacío, los cuales son multiplicados en un proceso de emisión secundaria. El tubo fotomultiplicador tiene una alta sensibilidad y un bajo ruido.

30 Detector Puede ajustarse un valor Gain y un valor Offset para cada detector. El valor Gain permite modificar el refuerzo de la señal detectada y, de esta forma, también la luminosidad y el contraste de la imagen. El valor Offset permite determinar el valor umbral. Sólo se detectan y muestran en la imagen las señales que están por encima de este valor umbral.

31 Detector

32 Detector Un valor elevado de Gain aumenta la entrada de ruido y puede dar una señal saturada.

33 Detector Se ajusta ayudándose de una paleta de colores Glow over-under "Glow (O&U)" visualiza el valor máximo azul y el valor mínimo verde. Por ello, está especialmente indicada para la optimización de la calidad de imagen.

34 Detector

35 Ajustes de instrumentación Equilibrio entre: Potencia del láser Tamaño del pinhole Ganancia del fotomultiplicador