INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA
|
|
- Clara Roldán Velázquez
- hace 6 años
- Vistas:
Transcripción
1 INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA Al incidir radiaciones electromagnéticas de longitud de onda adecuada sobre las moléculas orgánicas se puede producir una transición desde el estado electrónico fundamental hasta un estado electrónico excitado, generalmente el primero. Si bien en una solución a temperatura ambiente la mayor parte de las moléculas suelen encontrarse en su nivel vibracional fundamental, tras la excitación radiante pueden pasar a un nivel vibracional más elevado del primer estado electrónico excitado. Los estados excitados son inestables; por tanto, existe en las moléculas una tendencia a retornar al estado electrónico fundamental. La molécula, para perder el exceso de energía absorbida y volver el estado de mínima energía y por tanto el más estable. En fluorescencia esa energía se pierde en forma de un fotón, sin cambio en la multiplicidad del spin. La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos tan sencillos como complejos. El tipo más sencillo es el que presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo, los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de y Å. Después de excitados los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiación de estas dos mismas longitudes de onda en todas las direcciones. Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia. Muchas especies moleculares también presentan fluorescencia de resonancia. Sin embargo, es mucho más frecuente encontrar bandas de fluorescencia molecular centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia. Este desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores energías se denomina desplazamiento stokes. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fluorescencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta / visible. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida. El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se reduce en un factor de 100 o más).las señales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido del tratamiento de los datos para obtener la relación entre la intensidad de la fuente de radiación. 1
2 La sofisticación, las características de funcionamiento y el coste de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren de unos a otros como ocurre con los correspondientes instrumentos para las medidas de absorción. Los fluorómetros son análogos a los fotómetros de absorción, en ambos se utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de los haces de excitación y emisión. Los espectrofluorímetros son de dos tipos. Los primeros utilizan un filtro adecuado para seleccionar la radiación de excitación y un monocromador de red o de prisma para obtener el espectro de fluorescencia. Se pueden adquirir varios espectrofotómetros comerciales con adaptadores que permiten utilizarlos como espectrofluorímetros. Los verdaderos espectrofluorímetros son instrumentos especializados equipados con dos monocromadores; uno de ellos permite variar la longitud de onda de excitación y el otro permite obtener un espectro de emisión. La siguiente figura a muestra un espectro de excitación del antraceno en el que la emisión fluorescente se midió a una longitud de onda fija, mientras se variaba la longitud de onda de excitación, mientras se variaba la longitud de onda de excitación. Si se efectúan las correcciones adecuadas para compensar las variaciones de la intensidad de la señal de salida de la fuente y de la respuesta del detector en función de la longitud de onda, se obtiene un espectro de excitación absoluto que es muy semejante al espectro de absorción. La figura b muestra el espectro de emisión de fluorescencia del antraceno; aquí, la longitud de onda de excitación se mantuvo constante mientras se hacía un barrido de las longitudes de onda de emisión. Estos dos espectros son como una imagen especular uno del otro, ya que las diferencias de energía vibracional para los estados electrónicos fundamental y excitado son más o menos las mismas. La selectividad que proporcionan los espectrofluorímetros es de capital importancia en las investigaciones relacionadas con las características electrónicas y estructurales de las moléculas y es valiosa en los trabajos analíticos cualitativos y cuantitativos. Sin embargo, para medidas de concentración, la información proporcionada con instrumentos más sencillos es a menudo completamente satisfactoria. De hecho, los fluorómetros, relativamente baratos, que han sido diseñados específicamente para solventar los problemas de medida propios de los métodos fluorescentes, son a menudo tan específicos y selectivos como los espectrofotómetros de absorción modificados. La discusión que sigue está enfocada, en gran parte, a instrumentos sencillos para el análisis por fluorescencia. COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFOTÓMETROS Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros constan generalmente de: Fuentes Lámparas Fuentes: lámparas,láseres Filtros y monocromadores cubetas portamuestras Detectores Sistema electrónico y registrador Los factores primarios a considerar cuando se selecciona una fuente radiadora para instrumentación de fotoluminiscencia son la intensidad de la lámpara, la distribución de longitudes de onda de la radiación que la fuente emite y su estabilidad. De interés particular es la dependencia lineal de la señal luminiscente con la potencia de la radiación de excitación. En consecuencia, se tiene la ventaja al usar una fuente tan potente como sea posible. Los espectrofluorómetros de barrido requieren fuentes de radiación que emitan 2
3 continuamente sobre un amplio intervalo espectral. Los fluorómetros de filtro o espectrofluorómetros que se usan específicamente para mediciones analíticas a longitudes de onda fijas pueden usar fuentes espectrales de líneas atómicas. Lámparas de arco de alta presión de xenón se usan en casi todo espectrofluorómetro comercial. La lámpara de xenón emite un intenso y relativamente estable continuo de radiación que se extiende de los 300 a los 1300 nm. Varias líneas de emisión fuerte se encuentran entre 800 y 1100 nm. Su salida espectral se aproxima a la del radiador negro con temperatura de color equivalente a 6000 k aprox. Durante la operación de la lámpara la descarga de arco se comprime dentro del estrecho espacio que hay entre los electrodos, el parpadeo del arco determina la estabilidad de corto plazo, aproximadamente de 0,3%. La estabilidad de largo plazo se acerca a 1% por hora y está limitada por el desgaste del electrodo y la divagación del arco. En contraste con los arcos de mercurio, la distribución espectral no depende en alto grado de la presión del gas de operación ni del voltaje. Una lámpara de destello de xenón es una fuente compacta de poco costo. La muestra es excitada por un destello de alta energía producida por la descarga de un capacitor previamente cargado, a través de la lámpara llena de xenón. Haciendo repeticiones del destello, pueden usarse dispositivos de CA para amplificación y aprovechar todas las ventajas de la altura del pico de intensidad de destello. Una lámpara de destello capilar de 0.8 mm de diámetro tiene ventajas obvias para arrglos con microceldas y en flujo continuo, puesto que la imagen producida en la posición de la muestra es de aprox. 2mm de ancho y 18 mm de alto. Lámaparas de vapor de mercurio de baja presión son más frecuentemente utilizadas en los fluorómetros de filtro. La presión de llenado del gas es muy baja (aprox. 10 torr). La descarga de arco resultante es muy difusa especialmente y mucho menos intensas que la de un arco de alta presión. Su estabilidad es generalmente mejor. Estas lámparas pueden ser recubiertas con fósforo para emitir un espectro más cercano al continuo, o pueden tener un bulbo claro de material que transmite el UV para permitir el uso de líneas individuales del mercurio. Se usan filtros de interferencia para seleccionar las líneas individuales del mercurio para la excitación, o se emplean filtros de paso de banda para seleccionar varias líneas a la vez. Las líneas de emisión discontinuas que salen de la lámpara de mercurio muestran una sensibilidad considerable para un material cuyo espectro de excitación coincide con una línea de emisión de mercurio, pero la sensibilidad es menor para un compuesto que sea más fuertemente fluorescente, el cual se excita más eficientemente con otra longitud de onda de excitación que no se encuentra presente a la salida de la lámpara de mercurio. Láseres Desde los años 70, se utilizan también diversos tipos de láseres como fuentes de excitación para medidas de fotoluminiscencia. Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrogeno pulsante o un láser de Nd: YAG. La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequñas como en cromatografía con microcolumnas y en elctroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un l o menor;(2) en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales hidroxilo en la atmósfera o de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza colimada de los haces de láser es vital; o (3) cuando se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes. Filtros y monocromadores 3
4 Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la radiación fluorescente resultante. La mayoría de los espectrofluorímetros están equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red. Cubetas portamuestras Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación dispersada que llega hasta al detector. Con este propósito, a menudo, se introducen deflectores en el compartimento. Incluso más importante que en las medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia fluorece. Hay cuatro medios para iluminar e inspeccionar la muestra: el método de ángulo recto (90 ), el frontal (37 ), el de celda de rotación y el de paso directo. En las siguientes fotos se ilustra los tres primeros métodos. La configuración de ángulo recto es eficiente porque ninguna de las superficies de la celda portamuestras iluminadas directamente por el haz de excitación queda frente al monocromador de emisión; entonces, ninguna fluorescencia debida a la celda (proveniente de trazas del uranio contenido en algunos vidrios y del cuarzo) ni radiación reflejada de estas superficies entra al monocromador de emisión. La radiación dispersada sólo se origina en el seno mismo de la solución. En el modo de inspección a 90, la radiación de excitación circula por un paso de solución bastante largo, de manera que hay un límite de concentración superior antes de que la atenuación o la radiación de excitación interrumpan la relación lineal entre la potencia luminiscente y la concentración del soluto. La disposición de las rendijas de entrada y salida, como se observa en la siguiente figura tiene influencia sobre la longitud de paso efectivo (o en el volumen crítico inspeccionado. El método frontal de iluminación de la celda se usa en primer lugar, para materiales semiopacos o para sólidos, o para soluciones que muestran gran absorción. La desventaja de esta configuración es que el monocromador de emisión se ve directamente iluminado por una superficie de la celda, que tiene su propia fluorescencia residual y refleja radiación inevitablemente. La radiación reflejada se minimiza seleccionando un ángulo de 37 como ángulo de despegue. El método de la celda en rotación es un modo de evaluar y corregir la potencia fluorescente por la absorción del rayo primario (o de excitación) y por la absorción del rayo secundario (o de emisión). La celda se hace girar de manera que se efectúan las tres mediciones en las posiciones 1 y 2 es una medida de la absorción de la radiación de excitación por la muestra. Detectores La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relación señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros, los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el registro rápido de los espectros de excitación y de emisión y particularmente son útiles en cromatografía y en elctroforesis. DISEÑO DE INSTRUMENTOS Fluorómetros de filtro Los fluorómetros de filtro ofrecen la ventaja de bajo costo y conveniencia para determinaciones cuantitativas rutinarias. En los fluorómetros las longitudes de onda de excitación y de emisión se escogen con filtros de absorción o de interferencia. Para análisis de rutina la pérdida de versatilidad no es un inconveniente mayor, 4
5 en tanto que la alta sensibilidad que puede lograrse si la longitud de onda de excitación corresponde con una línea de emisión de la fuente, puede ser una gran ventaja. El tamaño pequño de los filtros, comparado con el de los monocromadores, da lugar a un instrumento compacto. Un fluorómetro de filtro generalmente consta de una lámpara de mercurio como fuente de excitación, un filtro primario para transmitir la longitud de onda excitacional deseada y la cubeta portamuestras. En tubo fotomultiplicador mide la emisión fluorescente. El filtro secundario, entre la muestra y el fotodetector, se elige para transmitir la fluorescencia y para absober la radiación de excitación dispersada. Si celdas de flujo se incorporan en el compartimiento de la muestra, pueden formar parte de un sistema de instrumentación de flujo continuo, tal como en los sistemas de detección de la cromatografía líquida de alta resolución. El uso de filtros ópticos se traduce en niveles de radiación excitadora muy altos y en una detección eficiente, pero se sacrifica la selectividad obtenida por una selección más precisa de las longitudes de onda de excitación y emisión con los monocromadores. Los filtros de excitación son generalmente del tipo de paso de banda, que transmiten una banda bastante ancha de longitudes de onda, aunque se usan los filtros de interferencia para aislar líneas de mercurio particulares. Transmisión extra banda y, en consecuencia, un nivel de radiación parásita generalmente muy elevado, es características de los filtros de interferencia cuando se compara con los filtros de absorción. Esto se atribuye a picaduras o defectos en los recubrimientos de las películas. Los filtros de emisión son comúnmente del tipo de corte nítido, en donde pasan las longitudes de onda largas y se atenúan las longitudes de onda más cortas, un punto para recordar res que los filtros de paso de banda tienen más de una banda de transmisión o ventana. Los fotodetectores tienen a menudo una respuesta de bajo nivel en un gran intervalo de longitudes de onda. Esto puede dar una señal de radiación parásita elevada. Los filtros de corte nítido, en particular si son de vidrio, frecuentemente presentan cierta fluorescencia. Los fluorómetros de filtro casi siempre usan un arreglo de un solo rayo con un control de intensidad de la fuente para disminuir los efectos de las fluctuaciones y la deriva en la intensidad de la fuente para disminuir los efectos de las fluctuaciones y la deriva en la intensidad de la fuente y en la respuesta del detector. Se dispone de una variedad de ingeniosas formas de obtener un canal de muestreo o monitoreo. Una parte de la radiación de la lámpara pasa a través del sistema óptico primario y se atenúa mediante un disco de apertura de referencia y la señal de la muestra que proviene del fotodetector de la muestra se aplican un divisor electrónico de estado sólido, que se encarga de calcular el cociente muestra/referencia de señales. La lectura del medidor o el cuadrante es proporcional a la concentración. Las mediciones pueden extenderse a concentraciones extremadamente pequeñas, aumentando la sensibilidad del fotodetector o la intensidad de la fuente de radiación. Las mediciones de fluorescencia se hacen usualmente con referencia a algún estándar elegido arbitrariamente. El estándar se coloca en el instrumento y el circuito se balancea con la escala de lectura a algún valor previamente escogido. Sin volver a ajustar ninguno de los componentes del circuito, el estándar se reemplaza por soluciones conocidas del analito y se registra la fluorescencia de cada una de ellas. Finalmente se mide la fluorescencia del solvente y de la celda juntos para establecer la lectura real de concentración igual a cero. Algunos fluorómetros están equipados con un circuito de ajuste a cero. Una gráfica de las lecturas de fluorescencia contra la concentración de las soluciones de referencia da lugar a una curva de calibración. Algunos estándares de fluorescencia comúnmente utilizados son la rodamina B en etilenglicol, el sulfato ácido de quinina en sulfúrico 0.1N el triptófano en agua y el antraceno en ciclohexano o en etanol. Filtros de referencia de vidrio también son convenientes. ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN Antes de explicar el funcionamiento y estructura de un espectrofluorómetro se debe de explicar dos conceptos importantes. Con los espectrofluorómetros se pueden obtener dos tipos de espectro: 5
6 de excitación: es una representación del número de fotones absorbidos por la molécula en función de la longitud de onda. Para registrar el espectro de excitación se fija el monocromador secundario de emisión a una longitud de onda determinada (la longitud de onda de fluorescencia máxima), y se hace un barrido exploratorio de longitudes de onda con el monocromador primario de excitación. Las rendijas de excitación han de ser lo suficientemente estrechas como para permitir obtener el espectro bien resuelto. de emisión: se obtiene fijando el monocromador primario a la longitud de onda en la cual existe un máximo en el espectro de excitación, haciendo un barrido espectral con el monocromador secundario. Al registrar un espectro de fluorescencia, las curvas obtenidas representan la variación de la corriente del fotomultiplicador en función de la longitud de onda de fluorescencia que incide sobre el fotomultiplicador, teniendo en cuenta que la magnitud de la corriente fotoeléctrica es proporcional a la intensidad de la señal de fluorescencia. Los espectros de fluorescencia se encuentran a menudo acompañados por cuatro bandas indeseables que dificultan su estudio: dispersión Rayleigh dispersión Raman posible fluorescencia del solvente y de la cubeta máximos de segundo orden, cuando de emplean como selector de radiaciones redes de difracción. Sin embargo, en la práctica resulta sencillo distinguir estas cinco emisiones, y detectar la fluorescencia que será el objetivo propuesto. El espectro de emisión de los compuestos fluorescentes es especialmente sensible al entorno molecular. Por ello, el estudio de los factores ambientales que pueden afectar al proceso de fluorescencia es muy importante. ESPECTROFLUÓROMETRO El mayor alcance analítico del análisis por fluorescencia se logró al reemplazar los filtros por monocromadores de rejilla para obtener un barrido de longitudes de onda en la región de 200 a 800 nm, la región más útil para la técnica de fluorescencia. Otra ventaja de la espectrofluorometría es que el analista ve la radiación dispersa al comparar el espectro de la muestra contra un espectro de referencia y al examinar la distorsión de los picos de fluorescencia o la presencia de picos adicionales. Usualmente tienen incorporados monocromadores de rejilla del tipo Czarny Turner, con una distancia focal de 0,25 m y una apertura f/4 o f/5. los monocromadores usan rejillas con 600 estrías/mm, marcadas para 300 nm en la unidad de excitación y para 500 nm en la unidad de emisión. Se usan filtros para bloquear radiación difractada de orden mayor. El monocromador de excitación se localiza entre la fuente de radiación y la muestra, y el monocromador de emisión se halla entre la muestra y el tubo fotomultiplicador. Para hacer análisis cuantitativo, se seleccionan las longitudes de onda deseadas de excitación y de emisión y se comparan las potencias fluorescentes relativas del estándar y de las muestras problema. Para tener una buena selectividad espectral y poder resolver la estructura fina de los espectros, el monocromador de emisión debe ser capaz de resolver dos líneas con 6
7 diferencia de 0,1 nm. Los instrumentos que miden las características de la muestra sin una comparación continua con un estándar de referencia tienen los mismos inconvenientes mayores que se presentan al intentar registrar espectros de absorción con un instrumento de un solo haz. Si la fuente es inestable y varía en intensidad, puede crear picos falsos en el espectro. Igualmente graves son las variaciones en la sensibilidad del fotodetector con respecto a la longitud de onda. El término no corregido se aplica a este tipo de espectrofluorómetro, porque los espectros de excitación y de emisión que se presentan son una combinación del espectro real de un compuesto y diversos equipos instrumentales. Cuando se grafican los espectros de excitación reales, de la distribución espectral a la salida de la lámpara y de la eficiencia del monocromador de excitación con la longitud de onda. Asimismo, los espectros de emisión obtenidos son combinación de los espectros de emisión reales, de la distribución espectral de la respuesta del detector y de la eficiencia del monocromador de emisión con la longitud de onda. En ciertas regiones del espectro estos factores instrumentales se vuelven dominantes. A pesar de estas desventajas, el espectrofluorómetro no corregido se utiliza para análisis cuantitativos con la conveniencia de que las longitudes de onda se seleccionan y usan para comparaciones bastas de los espectros obtenidos en otros laboratorios, y para comparaciones directas de los obtenidos dentro del mismo laboratorio. Las limitaciones instrumentales causadas por la inestabilidad de la fuente de xenón son eliminadas por la operación en modo cociente o razón. Una pequeña fracción de la radiación excitadora es dirigida hacia un fotodetector de referencia, que en primera instancia se escoge para una respuesta amplia en longitudes de onda. La radiación emitida se aisla con un fotodetector de emisión especialmente seleccionado con una corriente oscura pequeña y alta sensibilidad. La señal de salida de fototubo de referencia se amplifica y se alimenta a un circuito controlador de voltaje por dínodo fotomultiplicador, el cual se usa como un monitor para controlar el voltaje del dínodo de ambos tubos fotomultiplicadores en una relación inversa. Conforme la radiación excitadora aumenta o disminuye en potencia por las fluctuaciones de la lámpara de xenón, hay un aumento o una disminución correspondientes en la fluorescencia relativa. El detector de referencia es el componente del sistema con la velocidad y la amplitud de respuesta necesarias para examinar la potencia radiante de excitación. Como la señal se examina después del monocromador de excitación, los espectros de excitación son compensados por las fluctuaciones de energía dependientes de la longitud de onda. Sin embargo, este procedimiento no aporta un verdadero espectro de excitación corregido. Conforme el entrecortador gira, toda la radiación es bloqueada en un tubo fotomultiplicador o en el otro. Cualquier señal de un detector durante el periodo en que el cortador bloquea la radiación que proviene de él es una corriente oscura inherente al detector. Las señales de los dos fotomultiplicadores, ahora separados en el tiempo, se alimentan a un amplificador diferencial, que efectivamente resta la corriente oscura y que muestra el registrador sólo la diferencia de la señal. Monocromación doble El diagrama óptico de un instrumento que usa monocromacion doble se muestra en la siguiente figura. La sección óptica del instrumento comprende cuatro monocromadores de rejilla. Dos se usan en tándem para dispersar la energía de excitación y los otros dos se usan para examinar los espctros de fluorescencia. Un filtro óptico, colocado en el paso de la radiación entre la fuente de xenón y el monocromador de excitación elimina la excitación de segundo orden cuando las longitudes de onda excitacionales utilizadas son mayores que 400 nm. El monocromador doble reduce drásticamente la radiación dispersada y también permite el uso de rendijas más grandes para alcanzar la misma resolución que los monocromadores comunes, que tienen anchos de rendija más pequeños. Las rendijas más grandes permiten que pase más radiación a través del 7
8 monocromador de excitación para poder excitar la muestra. Esto es muy ventajoso para muestras a bajas concentraciones porque una cantidad máxima de energía se hace asequible sin sacrificar resolución. Espectrofluorómetro de fluorescencia de doble haz Por doble haz se entiende un sistema óptico electrónico que permite el uso de un segundo rayo de luz para lograr, esencialmente una compensación simultánea de la fluorescencia de la muestra por comparación con una muestra de referencia. En estas fotos se muestra un esquema de la óptica de estos instrumentos. El diseño, en concepto, utiliza un sistema electroóptico de tiempo compartido con pasos ópticos equivalentes para los haces de la muestra y de referencia y un cortador óptico para crear una señal de CA, así como para dividir el rayo. La lámpara de arco de xenón 150 W se enfoca hacia una rendija de entrada que se encuentra en la entrada del monocromador, después de que la radiación ha sido cortada ópticamente con un disco en forma de corbata de lazo. Un espejo secturado, localizado más allá de las rendijas de salida del monocromador de excitación, está unido por un eje común con el cortador. En el modo de fluorescencia de doble haz, la radiación emitida se observa en ángulo recto con la radiación de excitación, tanto para el rayo de la muestra como para el de referencia. La radiación de cada rayo se enfoca alternadamente en la rendija de entrada del monocromador de emisión usando espejos de superficie frontal comunes o equivalentes. El espejo de celosía es un espejo plano, semiluminado y semitransparente, que refleja el rayo de referencia y transmite el rayo de la muestra hacia el monocromador de emisión. Ambos rayos emergentes de las rendijas de salida del monocromador de emisión llegan al detector fotomultiplicador con una diferencia de fase de 180. Cuando el entrecortador abre por primera vez, el espejo secturador refleja el rayo hacia la referencia. Cuando el disco cortador por segunda vez, el espejo también abre y, por lo tanto, permite que pase la radiación hacia la muestra. En el tiempo restante de cada revolución del entrecortador, se mide el cero óptico, mientras se interpone la parte opaca del disco. La técnica de doble haz suministra una mayor precisión analítica, mayor conveniencia y mayor velocidad que las técnicas de un solo haz comparables, ya que elimina la dispersión interferente y la fluorescencia de los reactivos. También hace posible la medición de pequeñas diferencias entre dos muestras fluorescentes muy similares. La corrección completa del espectro de excitación se hace registrando el cociente de la señal de salida del detector de la muestra con respecto a la de un detector referencia que toma muestras de la emisión de un contador cuántico. El contador cuántico es una celda especial que contiene una concentración elevada de un material fluorescente, que a menudo es la rodamina B. Sobre un intervalo considerable de longitudes de onda de excitación, toda energía incidente es absorbida y una fracción cuántica fija es reemitida prácticamente a una sola longitud de onda (640 nm). Entonces, una parte de este haz emitido se deja llegar alternadamente al mismo fotomultiplicador que se usa para medir la emisión fluorescente de la muestra. Las señales provocadas por la luz del contador cuántico y por la muestra se separan eléctricamente y se usan para operar un registro de cocientes. Ya que la luz emitida por el contador cuántico es proporcional a los quanta que se dejan llegar a la muestra, se obtienen automáticamente espectros de excitación corregidos. La computadora de espectros corregidos almacena automáticamente factores de corrección de tal manera que genera y almacena una curva de error tanto para los espectros de excitación como para los de emisión. Las mediciones de fluorescencia corregida brindan información útil concerniente a los estudios de transferencia de energía (Inter e intramoleculares), a la energía de los desplazamientos de Stokes y a los estudios de macromoléculas. Dado que, en fluorescencia, un espectro de excitación corregido es idéntico a un 8
9 espectro de absorción pero 1000 veces más sensible, se aplica con ventaja en el análisis de trazas que comúnmente usan la espectrofotometría de absorción UV visible. PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. En la imagen se muestra el esquema de funcionamiento de un microscopio de epifluorescencia, en el que la luz incide sobre la preparación a través de las lentes del objetivo. Este microscopio, de gran poder de resolución tiene que tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la luz ultravioleta. En el esquema se sitúan los tres elementos característicos del microscopio de fluorescencia: Primer filtro de corte o filtro de excitación. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) Espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra. Segundo filtro de corte o filtro de emisión. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caos deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. En el esquema los filtros que se han indicado serían los que emplearíamos la fluorescencia asociada al isotiocianato de fluoresceína, molécula fluorescente ampliamente utilizada en microscopía de fluorescencia acoplada a anticuerpos. Existe un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos, inclusive conjuntos que permiten la observación simultánea de dos fluorocromos. Es de gran importancia seleccionar el adecuado conjunto de filtros para la observación. En las imágenes que encontrarás a continuación encontrarás el resultado de la observación de una preparación de células Ptk2 en las que se ha inmunodetectado la tubulina mediante anticuerpos acomplejados a fluoresceína (verde), y se ha teñido el núcleo con DAPI (azul). Se muestra el espectro característico de tres sistemas de filtros (WU, WIB y FITC&DAPI) de la empresa Olympus y las tres imágenes obtenidas. Filtros espectros imagen WU Se detecta la emisión de DAPI pero no la de FITC por su baja excitación. 9
10 WIB Se detecta la emisión de FITC pero no la de DAPI pues no es excitado. FITC & DAPI El filtro de dos bandas FITC y DAPI permite la correcta excitación y detección simultánea de FITC y DAPI. técnica Contraste de fases + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la de contraste de fases y la tercera a la combinada. Interferencial de Nomarski + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la interferencial de Nomarski y la tercera a la combinada. estructura de los grupos ópticos imagen En numerosas ocasiones es muy conveniente combinar la observación de la preparación con dos técnicas diferentes, una panorámica que informe del aspecto general de la misma (por ejemplo microscopía de contraste de fases o microscopía interferencial) y una segunda que nos dé una imagen específica de uno o pocos componentes (por ej. la microscopía de fluorescencia). A continuación tienes dos ejemplos de estas técnicas combinadas. Microscopía de fluorescencia confocal La observación microscópica es posible cuando se dispone de objetos pequeños o de secciones finas del material a observar. Dependiendo de las condiciones de la observación se observa simultáneamente un cierto grosor de la muestra (profundidad de campo). En las observaciones con el microscopio de fluorescencia puede suponer observar al mismo tiempo todo el grosor de una célula. La discriminación en planos o imágenes independientes siempre es posible, aunque técnicamente complejo, mediante la obtención de secciones correspondientes a planos consecutivos. La microscopía de fluorescencia confocal aporta otra solución mucho más directa. Mediante el empleo de fuentes de iluminación de gran intensidad y sincrónicas, de un juego de diafragmas y de un sistema de captación de imagen electrónico, permite la obtención de imágenes de finas secciones ópticas. A partir de series de secciones ópticas de este tipo obtenidas a diferentes profundidades, archivadas en un ordenador, resulta posible reconstruir una imagen tridimensional. A pesar de que los detalles ópticos del microscopio de fluorescencia confocal son complejos, la idea es sencilla. El sistema óptico del microscopio, generalmente fluorescente, no ilumina toda la preparación a la vez, sino que en cada momento sólo ilumina un pequeño punto a una cierta profundidad de la muestra. Para ello se necesitan fuentes luminosas de gran potencia, habitualmente haces láser, cuya luz pasa a través de un diafragma. La luz fluorescente emitida por la preparación se recoge y produce una imagen a la entrada de un 10
11 fotodetector adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar que es confocal con el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el punto iluminado de la muestra quedan enfocados. La luz que procede de ese punto penetra en el detecto, mientras que la que procede de otras regiones de la muestra queda fuera de foco en el diafragma y no es detectada. La muestra es barrida por el punto luminoso de una manera similar al barrido que forma la imagen en una pantalla de TV. La imagen bidimensional, digital, se forma al almacenar en una matriz numérica las intensidades luminosas medidas en cada uno de los puntos del barrido. La imagen en un microscopio confocal se forma en un sistema electrónico y se genera uno o más ficheros que contienen tanto las imágenes obtenidas como la información acerca de las condiciones en que se han tomado. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA 2. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA 3. COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFLUORÓMETROS: FUENTES FILTROS Y MONOCROMADORES CUBETAS PORTAMUESTRAS DETECTORES 4. DISEÑO DE INSTRUMENTOS FLUORÓMETROS DE FILTRO ESPECTRO DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN ESPECTROFLUORÓMETRO. MONOCROMACIÓN DOBLE. ESPECTROFLUORÓMETRO DE FLUORESCENCIA DE DOBLE HAZ 5. PRINCIPIO DE LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA CONFOCAL BIBLIOGRAFÍA PRINCIPIOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL SKOOG/HOLLER/NIEMAN EDITORIL MC GRAW HILL QUINTA EDICIÓN ANÁLISIS INSTRUMENTAL SKOOG/LEARY EDITORIAL MC GRAW HILL CUARTA EDICIÓN ANÁLISIS INSTRUMENTAL D.A.WEST/D.A.SKOOG EDITORIL MC GRAW HILL TÉCNICAS INSTRUMENTALES EN FARMACIA Y CIENCIAS DE LA SALUD Dr. ORIOL VALLS/Dr. BENITO DEL CASTILLO EDICIONES PIROS CUARTA EDICIÓN 11
12 MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS WILLAR/LYNNE J. MERRIT/JOHN DEAN/FRAN A. SETTLE EDITORIAL IBEROAMERICANA 12
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA MOLECULAR Q.F. ALEX SILVA ARAUJO
FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA Q.F. ALEX SILVA ARAUJO GENERALIDADES Aquí se considerarán tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí: fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia.
Más detallesESPECTROSCOPIA Q.F. ALEX SILVA ARAUJO
Q.F. ALEX SILVA ARAUJO INSTRUMENTOS PARA ESPECTROSCOPIA OPTICA Los primeros instrumentos espectroscópicos se desarrollaron para ser utilizados en la región del visible (instrumentos ópticos). En la actualidad
Más detallesESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE:
ESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE: Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las moléculas de analíto
Más detalles8. Instrumentación del microscopio confocal espectral
8. Instrumentación del microscopio confocal espectral Parámetros importantes del microscopio confocal: Fuente de iluminación: Láser Pinhole Detector: Fotomultiplicador! Microscopio óptico Microscopio óptico
Más detallesMicroscopio óptico. Aumento total = aumento objetivo x aumento ocular. Ocular Capta y amplía la imagen formada en el objetivo
Microscopía óptica El microscopio Microscopio óptico Ocular Capta y amplía la imagen formada en el objetivo Objetivo Sistema de lentes delgadas: proyecta una imagen real, aumentada e invertida de la muestra
Más detallesEspectrometría de luminiscencia molecular Cap.15
Espectrometría de luminiscencia molecular Cap.15 Luz cuyo origen no radica exclusivamente en las altas temperaturas Se da en sustancias que pueden absorber energía, excitándose a niveles mayores y emitirla
Más detallesFundamentos de la microscopía de fluorescencia
Fundamentos de la microscopía de fluorescencia Andrés Esteban Cantos y Covadonga Alonso Martí Laboratorio de Interacción virus-célula Departamento de Biotecnología del INIA 1) La fluorescencia y sus propiedades
Más detallesQuímica Biológica TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA.
TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA. Introducción Al observar una solución acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloración, la cual se debe a la interacción entre las moléculas del colorante y la
Más detalleselectroforesis capilar Sistema de detección
2.3.3 Sistema de detección La detección es uno de los mayores retos de la técnica de CE, ya que el reducido diámetro interno de los capilares, la pequeña cantidad de muestra inyectada y el hecho que la
Más detallesANALISIS INSTRUMENTAL QUIMICA FARMACÉUTICA
ANALISIS INSTRUMENTAL QUIMICA FARMACÉUTICA Conferencia 2: Espectrometría de absorción atómica (AA): técnicas de atomización de muestras (atomización de llama y atomización electrotérmica), técnicas de
Más detallesEsquema general de un fotómetro sencillo
Esquema general de un fotómetro sencillo 1. Una fuente de radiaciones (lámpara) que genera la señal emitiendo un espectro continuo o de líneas según el instrumento. 2. Un sistema selector que permite seleccionar
Más detallesSeries espectrales del hidrógeno
Hidrógeno Series espectrales del hidrógeno Lyman Balmer Pfund Paschen 1 2 3 4 5 6 n=7 Brackett Lyman Balmer Paschen Brackett Pfund 1000 2000 5000 10000 UV Visible IR Transiciones electrónicas atomo ionizado
Más detallesINTRODUCCION A LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION MOLECULAR UV/VIS Y DE INFRARROJO CERCANO. Cap. 13
INTRODUCCION A LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION MOLECULAR UV/VIS Y DE INFRARROJO CERCANO Cap. 13 Medición de la absorbancia y la transmitancia Recipiente produce pérdidas por: reflexión (aire/pared, pared/solución)
Más detallesESPECTROFOTÓMETROS UV- VISIBLE COMPONENTES
ESPECTROFOTÓMETROS UV- VISIBLE COMPONENTES INSTRUMENTAL EL INSTRUMENTO QUE NORMALMENTE SE UTILIZA PARA MEDIR LA TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA ES EL ESPECTROFOTÓMETRO LOS COMPONENTES BÁSICOS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Más detallesEspectroscopía de Absorción Molecular
Espectroscopía de Absorción Molecular La espectroscopía consiste en el estudio cualitativo y cuantitativo de la estructura de los átomos o moléculas o de distintos procesos físicos y químicos mediante
Más detallesTÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN
TÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN Absorción de radiación y concentración. Ley de Beer. La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la transmitancia T o de la absorbancia
Más detallesESPECTROFOTOMETRIA. BASES FISICAS
ESPECTROFOTOMETRIA. BASES FISICAS Radiación Electromagnética y su Interacción con la Materia El principio de funcionamiento de la espectrofotometría se basa en el empleo de las interacciones entre la radiación
Más detallesEspectroscopía Clase integradora
Espectroscopía Clase integradora Qué es la espectroscopía? La espectroscopia es el estudio de la INTERACCIÓN entre la materia y energía radiante, por ejemplo, radiación electromagnética. Busca relacionar
Más detallesMétodos Espectrofotométricos. Capítulos 24 y 25 de Fundamentos de Química Analítica Skoog-West-Holler-Crouch (octava Ed.)
Métodos Espectrofotométricos Capítulos 24 y 25 de Fundamentos de Química Analítica Skoog-West-Holler-Crouch (octava Ed.) 1 Radiación electromagnética Longitud de onda : Frecuencia en s -1 Hertz Numero
Más detallesmicroscopio epi-fluorescencia
microscopio epi-fluorescencia microscopio epi-fluorescencia Ciertas sustancias en virtud de su estructura química son capaces de emitir luz de una determinada longitud de onda tras absorber luz de una
Más detallesProblema Interferencia de N ranuras.
Problema 9. 4. Interferencia de N ranuras. Considere un obstáculo con tres ranuras separadas por una distancia d e iluminado con una onda plana de longitud de onda λ. Emplee el método de los fasores para
Más detallesESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE
ESPECTROSCOPIA UV-VISIBLE FUNDAMENTOS INSTRUMENTACION FUNCIONAMIENTO APLICACIONES FUNDAMENTOS La espectroscopia UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la radiación ultravioleta-visible (radiación
Más detallesTipos de microscopios y sus aplicaciones
Tipos de microscopios y sus aplicaciones Hay varios tipos de microscopios, para saber cuál elegir lo primero que tenemos que preguntarnos es qué queremos ver. Microscopio Compuesto: Es el microscopio más
Más detalles6. Fundamentos de la microscopía confocal espectral
6. Fundamentos de la microscopía confocal espectral Microscopio confocal Microscopio confocal La distinción fundamental entre la microscopía óptica convencional y la microscopía óptica confocal es la manera
Más detallesDESARROLLO. La frecuencia tiene una relación inversa con el concepto de longitud de onda, a mayor frecuencia menor
CONSIGNAS TP1 Teoría de la luz Desarrollar una investigación teniendo como base el origen de la luz como fenómeno físico y su comportamiento. Dicho trabajo práctico requiere rigor en los datos técnicos
Más detallesLA ESPECTROSCOPIA PARA ESTUDIAR MATERIALES
LA ESPECTROSCOPIA PARA ESTUDIAR MATERIALES P. Nanco-Hernández 1, B. M. González Contreras 1, J.F. Casco Vázquez 2, T. Rodríguez Hernández 2 y E. J. Pérez-Mena 2. RESUMEN porfirionanco@hotmail.com 1.- Universidad
Más detallesPOLARIZACIÓN CON LÁMINAS DE CUARTO DE ONDA (λ/4)
POLARIZACIÓN CON LÁMINAS DE CUARTO DE ONDA (λ/4) 1. OBJETIVO - Estudiar cómo varía la intensidad de la luz, al atravesar dos polarizadores, en función del ángulo existente entre sus ejes de transmisión.
Más detallesREVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA
REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA OBJETIVOS Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Conocer el manejo de micropipetas
Más detallesLOS OBJETOS. Textos y fotos Fernando Moltini
LOS OBJETOS Textos y fotos Fernando Moltini Como son percibidos los colores de los objetos. Un cuerpo opaco, es decir no transparente absorbe gran parte de la luz que lo ilumina y refleja una parte más
Más detallesinteracción de la radiación con la atmósfera
1 interacción de la radiación lección 4 sumario 2 Introducción. Composición de la atmósfera. Efectos atmosféricos: Dispersión. Absorción. Correcciones atmosféricas. introducción 3 La atmósfera se interpone
Más detallesANÁLISIS INSTRUMENTAL_UII_PARTE DOS. Propiedades magnéticas de cuatro importantes núcleos que tienen un número cuántico de espín de ½
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ANÁLISIS INSTRUMENTAL_UII_PARTE DOS Propiedades magnéticas de cuatro importantes núcleos que tienen un número cuántico de espín de ½ Desplazamiento químico Desdoblamiento spin-
Más detallesFARMACOPEA MERCOSUR: MÉTODO GENERAL PARA ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
MERCOSUL/XLIII SGT Nº 11/P.RES. Nº FARMACOPEA MERCOSUR: MÉTODO GENERAL PARA ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE VISTO: El Tratado de Asunción, el Protocolo de Ouro Preto y las Resoluciones N 31/11
Más detallesINTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA
INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA Objetivos Al finalizar el trabajo práctico los estudiantes estarán en capacidad de: - Conocer el principio que rige la espectrofotometría. - Interpretar el basamento
Más detallesPRACTICO N 1: ESPECTROFOTOMETRIA
UNIVERSIDAD MAYOR FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA BIOQUIMICA PRACTICO N 1: ESPECTROFOTOMETRIA 1.- INTRODUCCIÓN Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría
Más detallesI.E.S. MARTÍNEZ MONTAÑÉS DEPARTAMENTO DE FÍSICA Y QUÍMICA ÓPTICA
Cuestiones ÓPTICA 1. a) Qué se entiende por interferencia de la luz? b) Por qué no observamos la interferencia de la luz producida por los dos faros de un automóvil? 2. a) Qué es una onda electromagnética?
Más detallesTema 1. Elementos de un sistema de Visión por Computador. Esquema general de un sistema de visión por computador
Tema 1 Elementos de un sistema de Visión por Computador Índice Esquema general de un sistema de visión por computador Esquema de un proceso de visión por computador Estructura típica de un sistema Fundamentos
Más detallesPreguntas del capítulo Ondas electromagnéticas
Preguntas del capítulo Ondas electromagnéticas 1. Isaac Newton fue uno de los primeros físicos en estudiar la luz. Qué propiedades de la luz explicó usando el modelo de partícula? 2. Quién fue la primer
Más detallesDel LASER I Principio de funcionamiento del láser
Del LASER I Principio de funcionamiento del láser Gilberto Basilio Sánchez La palabra láser proviene del acrónimo en inglés Ligth Amplification by Stimulated Emission of Radiation; en español, láser(1)
Más detallesSlide 1 / 52. Las Ondas Electromagnéticas Problemas de Práctica
Slide 1 / 52 Las Ondas Electromagnéticas Problemas de Práctica Slide 2 / 52 Multiopcion Slide 3 / 52 1 Cuál de las siguientes teorías puede explicar la curvatura de las ondas detrás de los obstáculos en
Más detallesSEÑALES Y RUIDO. SEÑAL Dominios de los datos. SEÑAL Dominios eléctricos. Fuente de energía. Sistema objeto de estudio. Información analítica
SEÑALES Y RUIDO Estímulo Respuesta Fuente de energía Sistema objeto de estudio Información analítica SEÑAL Dominios de los datos Dominios no eléctricos SEÑAL Dominios eléctricos Intensidad de corriente
Más detallesEspectroscopía de Absorción Molecular
Espectroscopía de Absorción Molecular La espectroscopía consiste en el estudio cualitativo y cuantitativo de la estructura de los átomos o moléculas o de distintos procesos físicos y químicos mediante
Más detallesESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR
ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR INTRODUCCIÓN La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas
Más detallesSISTEMA LASER. Introducción
SISTEMA LASER Introducción Anteriormente se presentaron los procesos físicos necesarios para producir amplificación de la luz en un sistema atómico. Ahora la atención se centra en cómo puede lograrse lo
Más detallesPara lograr una radiación de las características necesarias la fuente más común son las lámparas de cátodo hueco.
Fundamento teórico El fundamento más elemental de los métodos espectrométricos es la Teoría Cuántica, propuesta en 1900 por Max Planck, que postula que los átomos, iones y moléculas sólo pueden existir
Más detallesPrincipios básicos de Absorciometría
Principios básicos de Absorciometría Prof. Dr. Luis Salazar Depto. de Ciencias Básicas UFRO 2004 NATURALEZA DE LA LUZ MECÁNICA CUÁNTICA Isaac Newton (1643-1727) Niels Bohr (1885-1962) Validación del modelo
Más detallesEMISIÓN DE RADIACIÓN 24/05/2011
EMISIÓN DE RADIACIÓN La radiación electromagnética se origina cuando las partículas excitadas (átomo, iones o moléculas) se relajan a niveles de menor energía cediendo su exceso de energía en forma de
Más detallesESPECTROFOTOMETRÍA. 1. Naturaleza de la radiación electromagnética: 1 nm = 10-9 m
ESPECTROFOTOMETRÍA 1. Naturaleza de la radiación electromagnética: La radiación electromagnética es una forma de energía radiante. Tiene propiedades ondulatorias, propagándose en forma de ondas. En este
Más detallesTema 7: Técnicas de Espectroscopía atómica. Principios de espectrometría de Absorción y Emisión. Espectrometría de masas atómicas.
Tema 7: Técnicas de Espectroscopía atómica Principios de espectrometría de Absorción y Emisión. Espectrometría de masas atómicas. Espectroscopía Las técnicas espectrométricas son un amplio grupo de técnicas
Más detallesExperimento: Espectro de gases
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICO - MATEMÁTICAS Experimento: Espectro de gases Equipo α-pulpo Alma Elena Piceno Martínez Luke Goodman Ernesto Benítez Rodríguez 2012 F Í S I C A M O D E R N A C O N L A B O R
Más detallesTRABAJO PRÁCTICO N 14 ESPECTROMETRÍA REDES DE DIFRACCIÓN
TRABAJO PRÁCTICO N 14 Introducción La luz blanca ordinaria (luz del sol, luz de lámparas incandescentes, etc.) es una superposición de ondas cuyas longitudes de onda cubren, en forma continua, todo el
Más detallesIntroducción a. Remota
Introducción a la Percepción Remota La percepción remota se refiere a las actividades de registrar, observar y percibir objetos o eventos de un lugar distante (remoto). En un sentido estricto, la percepción
Más detallesFísica Experimental IV. Práctica XI Serie de Balmer. Funes, Gustavo Giordano, Leandro Gulich, Damián Sotuyo, Sara. Damián Gulich
Física Experimental IV Práctica XI Serie de Balmer Funes, Gustavo Giordano, Leandro Gulich, Damián Sotuyo, Sara Departamento de Física Facultad de Ciencias Exactas UNLP Sinopsis En el siguiente informe
Más detallesDescripción del equipo
La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica con la cual se logran excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc.).
Más detallesTRANSDUCTORES OPTOELECTRONICOS
TRANSDUCTORES OPTOELECTRONICOS Hay dos aspectos relacionados con la luz que se utilizan, juntos o separados, para explicar muchos fenómenos relacionados con ella. Fenómenos ópticos, tales como la interferencia
Más detallesÓPTICA FÍSICA. (luz) Física 2º bachillerato Óptica física (luz) 1
ÓPTICA FÍSICA (luz) 1. Ondas electromagnéticas. 2. Espectro electromagnético 3. Naturaleza de la luz. 4. Propagación de la luz. 5. Fenómenos ondulatorios. 6. Fenómenos corpusculares. Física 2º bachillerato
Más detallesEnlace: onda transversal. Enlace: onda longitudinal
La luz Qué es la luz? La luz es fuente de vida en la Tierra: posibilita la fotosíntesis de las plantas verdes; permite que podamos recibir y transmitir información de los objetos que nos rodean. Pero la
Más detallesCAPITULO I: La Luz CAPITULO I: LA LUZ 1
CAPITULO I: La Luz CAPITULO I: LA LUZ 1 1.- La luz 1.1.- El nanómetro 1.2.- El espectro visible 1.3.- Naturaleza de la luz 1.4.- Fuentes de luz 2.- La Materia y la luz 2.1.- Fórmula R.A.T. 22-2.2. Absorción
Más detallesFísica III clase 22 (09/06/2011) Partícula cuántica
Física III clase 22 (09/06/2011) Profesor: M. Antonella Cid Departamento de Física, Facultad de Ciencias Universidad del Bío-Bío Carreras: Ingeniería Civil Civil, Ingeniería Civil Mecánica, Ingeniería
Más detallesDetector de Mercurio por Fluorescencia Modelo 2500
Detector de Mercurio por Fluorescencia Modelo 2500 El Modelo 2500 es un detector de mercurio elemental por Espectrometría de Fluorescencia Atómica de Vapor Frío (CVAFS). Las ventajas de la fluorescencia
Más detallesProblemas de Ondas Electromagnéticas
Problemas de Ondas Electromagnéticas AP Física B de PSI Nombre Multiopción 1. Cuál de las siguientes teorías puede explicar la curvatura de las ondas detrás de los obstáculos en la "región de sombra"?
Más detallesANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Espectrometría Objeto de Estudio Nº 3 LECTURA N 5 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Bibliografía: SKOOG, D.A.; Leary J.J.; ANÁLISIS INSTRUMENTAL,
Más detallesPráctica Nº8. REFLEXIÓN Y REFRACCIÓN DE LA LUZ. Aplicación: índice de refracción del prisma.
Práctica Nº8 REFLEXIÓN Y REFRACCIÓN DE LA LUZ. Aplicación: índice de refracción del prisma. 1 Introducción. En esta práctica estudiaremos un elemento óptico: el prisma, que nos permitirá analizar los fenómenos
Más detalles5. Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia
y epifluorescencia Fluorescencia Espectro de luz visible: La longitud de onda determina el color Fluorescencia Qué es? Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material
Más detallesUnidad V Respuesta de los sistemas de control
Unidad V Respuesta de los sistemas de control MC Nicolás Quiroz Hernández Un controlador automático compara el valor real de la salida de una planta con la entrada de referencia (el valor deseado), determina
Más detallesFluorescencia. Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone
Fluorescencia Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone Para qué sirve? Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc. Estudiar procesos celulares:
Más detallesUNIVERSIDAD TECNOLÓGICA METROPOLITANA INGENIERIA EN QUIMICA LABORATORIO ANALISIS INSTRUMENTAL. INFORME N 1: ESPECTROFOTOMETRÍA UV VISIBLE INTRODUCCION
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA METROPOLITANA INGENIERIA EN QUIMICA LABORATORIO ANALISIS INSTRUMENTAL. INFORME N 1: ESPECTROFOTOMETRÍA UV VISIBLE INTRODUCCION En este laboratorio utilizaremos el método de la espectrofotometría
Más detallesPractica nº n 5: Fenómenos de Difracción.
Facultad de Farmacia Universidad de Granada Departamento de Química Física Practica nº n 5: Fenómenos de Difracción. OBJETIVOS 1.Observar los fenómenos de difracción Rendija simple Rendija doble 2.Calcular
Más detalles1. Introducción. e. V 0 = h. ν - φ (1)
Efecto fotoeléctrico Juan Kamienkowski, Sebastián Romano y Matías Travizano, kamandu@yahoo.com, juka44@yahoo.com.ar, slick@ussrback.com Laboratorio 5, Departamento de física, UBA- 2002 Resumen En el presente
Más detallesPROGRAMA DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL II
Programa de Análisis Instrumental II Página 1 de 8 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA ESCUELA DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE FISICOQUÍMICA PROGRAMA DE ANÁLISIS
Más detallesFísica Experimental IV. Práctica IV Determinación de h/e. Funes, Gustavo Giordano, Leandro Gulich, Damián Sotuyo, Sara.
Física Experimental IV Práctica IV Determinación de h/e Funes, Gustavo Giordano, Leandro Gulich, Damián Sotuyo, Sara Departamento de Física Facultad de Ciencias Exactas UNLP Sinopsis En el siguiente informe
Más detallesRADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA U.A. QUÍMICA ANALÍTICA CATEDRA: QUÍMICA ANALÍTICA II RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA HOMERO PEREZ RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Radiación
Más detallesANÁLISIS CUANTITATIVO POR WDFRX
ANÁLISIS CUANTITATIVO POR WDFRX El análisis cuantitativo se obtiene mediante la medida de las intensidades de las energías emitidas por la muestra. Siendo la intensidad de la emisión (número de fotones)
Más detallesTerapia Ocupacional 2012
Trabajo Práctico Nº 1 Terapia Ocupacional 2012 Miércoles 4 de abril de 2012 Trabajo Práctico Nº 1 MICROSCOPÍA, CÉLULA PRO Y EUCARIONTE Objetivos: 1. Conocer y comprender los principios y fundamentos básicos
Más detallesESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS II TÉRMINO SEGUNDA EVALUACIÓN DE FÍSICA D.
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS II TÉRMINO 2011-2012 SEGUNDA EVALUACIÓN DE FÍSICA D Nombre: Paralelo: PRIMERA PARTE: Ejercicios de opción múltiple (2 puntos c/u)
Más detalles13. Por qué no se observa dispersión cuando la luz blanca atraviesa una lámina de vidrio de caras planas y paralelas? 14. Sobre una lámina de vidrio,
PROBLEMAS ÓPTICA 1. Una de las frecuencias utilizadas en telefonía móvil (sistema GSM) es de 900 MHz. Cuántos fotones GSM necesitamos para obtener la misma energía que con un solo fotón de luz violeta,
Más detallesSistemas de iluminación. Autor: Miguel Ángel Asensio Adaptación: Luis Manuel Martín Martín.
Sistemas de iluminación Autor: Miguel Ángel Asensio Adaptación: Luis Manuel Martín Martín. 1 Parámetros de la luz Para poder controlar la iluminación es necesario considerar, al menos, tres parámetros
Más detallesPráctica 6: Redes de difracción F2 ByG 2º Cuat 2005
Práctica 6: Redes de difracción F2 ByG 2º Cuat 2005 Objetivos: Se propone medir el espectro de una lámpara de sodio utilizando redes de difracción. Se propone determinar los límites del espectro visible
Más detallesFundamentos de Espectrometría de Absorción Atómica
Fundamentos de Espectrometría de Absorción Atómica Dr. Carlos García Delgado Dto. Química Agrícola y Bromatología Máster en Gestión y Tratamiento de Residuos Curso 2016/2017 Aplicaciones de AA Determinación
Más detallesExamen Final Fisi 3162/3172 Nombre: lunes, 18 de mayo de 2009
Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagüez Departamento de ísica Examen inal isi 3162/3172 Nombre: lunes, 18 de mayo de 2009 Sección: Prof. Lea cuidadosamente las instrucciones. Seleccione
Más detallesTEMA 9 MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
TEMA 9 MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS INDICE DE CONTENIDOS Introducción Tipos de microscopía óptica Microscopía de campo claro Microscopía de campo oscuro
Más detallesSISTEMAS DE ILUMINACION LED
SISTEMAS DE ILUMINACION LED VENTAJAS Y DESVENTAJAS Leopoldo Rodríguez Rübke Luz Es una onda electromagnética que sensibiliza la retina de un ser humano. Sensibilidad a la luz Cómo se genera la luz Se produce
Más detallesDETECTORES DE RADIACIÓN
DETECTORES DE RADIACIÓN ( I ) - INTERACCIÓN RADIACIÓN-MATERIA CURSO 2012 2013 INTRODUCCIÓN La mayoría de los detectores de radiación presentan un comportamiento similar: 1. La radiación entra en el detector
Más detallesLASER DE HELIO-NEON. (Juan Israel Rivas Sánchez)
LASER DE HELIO-NEON (Juan Israel Rivas Sánchez) El láser de Helio-Neón fue el primer láser de gas construido y actualmente sigue siendo uno de los láseres más útil y frecuentemente utilizado. Esto a pesar
Más detallesTIPOS DE MICROSCOPIOS
TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio Estereoscópico: Hace posible la visión tridimensional de los objetos, y para lograrlo utiliza dos oculares (los que están cerca del ojo) y dos objetivos (los que se encuentran
Más detalles07/05/2017. ÓPTICA FÍSICA: difracción. Introducción a los patrones de difracción
ÓPTICA FÍSICA: difracción Dispositivo Delfina Fernandez y Damián Pontet, 2015 Introducción a los patrones de difracción Difracción es la desviación que sufren las ondas alrededor de los bordes y esquinas
Más detallesEJERCICIOS EFECTO FOTOELÉCTRICO
EJERCICIOS EFECTO FOTOELÉCTRICO Teoría Distribución de la radiación de cuerpo negro, según Planck: Esta era una expresión empírica, para explicarla teóricamente, Planck propuso un modelo detallado de los
Más detallesABSORCIÓN DE RADIACIÓN QUÍMICA ANALÍTICA III
ABSORCIÓN DE RADIACIÓN QUÍMICA ANALÍTICA III Tipos Colorímetro Fotómetro Espectrofotómetro Componentes Fuentes de radiación Selectores de longitud de onda Recipientes para muestras Detectores de radiación
Más detallesFundamentos de la microscopía confocal espectral
Fundamentos de la microscopía confocal espectral Andrés Esteban Cantos y Covadonga Alonso Martí Laboratorio de Interacción virus-célula Departamento de Biotecnología del INIA Qué es la microscopía confocal?
Más detallesProblemas de Óptica I. Óptica física 2º de bachillerato. Física
Problemas de Óptica I. Óptica física 2º de bachillerato. Física 1. Calcular la energía de un fotón de luz amarilla de longitud de onda igual a 5,8.10 3 A. Solución: 3,43.10-19 J. 2. Una de las frecuencias
Más detallesESPECTROMETRIA DE MASAS
ESPECTROMETRIA DE MASAS Se puede sub-dividir en dos áreas de aplicación: Espectrometría de masas atómica EMA: determinar cuali y cuantitativamente los elementos presentes en una muestra. Espectrometría
Más detallesLa ley de desplazamiento de Wien (Premio Nobel 1911):
Trabajo de laboratorio Nro 1: Verificación de la ley de Stefan Boltzmann y determinación de la constante de Planck mediante el análisis de la radiación del cuerpo negro Introducción Toda superficie cuya
Más detallesGuía de laboratorio Nº1 El microscopio y el estudio de las células
Guía de laboratorio Nº1 El microscopio y el estudio de las células NOMBRE: CURSO: FECHA: Objetivo: Conocer los tipos de microscopios, sus funciones y características, para observar distintas muestras de
Más detallesUNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA. Práctica N 01. Interferencia y Difracción
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Práctica N 01 Interferencia y Difracción Objetivos.- Estudio de los fenómenos de interferencia y difracción usando un láser como fuente de luz coherente y monocromática.
Más detallesEJERCICIOS DE SELECTIVIDAD LA LUZ Y LAS ONDAS ELECTROMAGNÉTICAS
EJERCICIOS DE SELECTIVIDAD LA LUZ Y LAS ONDAS ELECTROMAGNÉTICAS 1. Un foco luminoso puntual está situado bajo la superficie de un estanque de agua. a) Un rayo de luz pasa del agua al aire con un ángulo
Más detallesBases de la Microscopía Confocal
Procesamiento de Imágenes y Bioseñales Bases de la Microscopía Confocal Integrantes: Oscar Arellano Alexis Díaz Mario Pavez Roxana Sagüés 30 de Agosto 2014 Temario Introducción Tecnología Microscopía de
Más detalles1. a) Explique los fenómenos de reflexión y refracción de la luz. siempre refracción?
ÓPTICA 2001 1. a) Indique qué se entiende por foco y por distancia focal de un espejo. Qué es una imagen virtual? b) Con ayuda de un diagrama de rayos, describa la imagen formada por un espejo convexo
Más detallesEn el laboratorio hay espejos planos de varias reflectividades entre 80% y 98% -es
Apuntes de Gabriela Capeluto, Ana Amador y Fernando Rausch 1. Láser de Nd:YAG. Cavidades. En el laboratorio hay espejos planos de varias reflectividades entre 80% y 98% -es muy difícil hacer lasear estos
Más detallesMódulo 1.2 Lámparas: tipos y características. Héctor Beltrán San Segundo Universitat Jaume I - Fundación F2e
Módulo 1.2 Lámparas: tipos y características. Héctor Beltrán San Segundo Universitat Jaume I - Fundación F2e Contenido: Fenómenos que producen luz (principios físicos). Tipos de las lámparas según su modo
Más detallesDETECCION DE INCENDIOS CARLOS MARCOS VERDUQUE ARQUITECTO TÉCNICO
DETECCION DE INCENDIOS Se entiende por detección de incendios el hecho de descubrir y avisar que hay un incendio en un determinado lugar. La detección de un incendio se puede realizar por: Detección humana.
Más detallesFÍSICA MODERNA. a) Explique las transformaciones energéticas en el proceso de fotoemisión y calcule la
FÍSICA MODERNA 2001 1. Un haz de luz de longitud de onda 546 10-9 m incide en una célula fotoeléctrica de cátodo de cesio, cuyo trabajo de extracción es de 2 ev: a) Explique las transformaciones energéticas
Más detalles