Métodos de Estudio en Biología Celular

Transcripción

1 Métodos de Estudio en Biología Celular

2 A. INFORMACIÓN MORFOLÓGICA Microscopía Óptica Microscopía Electrónica Técnicas Cito-histológicas Cultivo in vitro de células y tejidos B. ORIENTACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Citoquímica-Histoquímica Inmunohistoquímica Autorradiografía C. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES Fraccionamiento Celular Ultracentrifugación Citometría de Flujo D. INFORMACIÓN ANALÍTICA A NIVEL MOLECULAR Cromatografía Electroforesis

3 Estructura Unidad de Medida Valor (mm) Método de estudio Organos, Tejidos y Células grandes Milímetro (mm) 1 Simple Vista Lupa Células y Organelos grandes Micrómetro (µm) 1 x 10-3 Microscopio Optico Componentes Celulares, Macromoléculas Nanómetro (nm) 1 x 10-6 Microscopio Electrónico Estructuras Moleculares Angström (Ä) 1 x 10-7 Microscopio Electrónico

4 Microscopía

5 todo instrumento que permite la observación de objetos pequeños o ver detalles de una muestra determinada que a simple vista no se percibiría

6 Microscopio Óptico

7 Partes de un Microscopio Sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes que permiten el movimiento para el enfoque. Sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que producen el aumento de las imágenes que se ven a través de ellas

8 Cabezal Revolver Brazo o Columna Platina Tornillos de enfoque Pie o Base

9 Oculares Objetivos Condensador Diafragma Fuente de Luz

10 Oculares Tienen la función de ampliar la imagen. Están formados por dos lentes dispuestos en un tubo corto. Los más utilizados son los de: 1OX, 12,5X y 15X.

11 Objetivos Permiten ampliar la imagen del objeto. El número varía con el tipo de microscopio y el uso.

12 Objetivos Secos 5X, 10X, 20X, 40X y 60X Inmersión: 100X

13 Condensador Está formado por un sistema de lentes que concentran los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. Se halla debajo de la platina y presenta un sistema de cremallera que permite su movimiento.

14 Diafragma Tiene la función de regular la cantidad de luz que entra en el condensador.

15 Fuente de iluminación Dirige los rayos luminosos hacia el condensador

16 Pie o Base Constituye el soporte sobre el cual se apoya el microscopio. Puede tener forma rectangular o bien de Y.

17 Brazo o Columna Es una pieza colocada en la parte posterior del aparato Sostiene el cabezal en su porción superior y por el extremo inferior se une al pie.

18 Platina Es una pieza plana donde se coloca la preparación. Presenta un orificio que permite el paso de la luz. Tiene tornillos laterales que permiten recorrer la preparación.

19 Cabezal Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.

20 Revolver Es una pieza giratoria que sostiene los objetivos. Permite cambiar los objetivos y observar una muestra en diferentes aumentos.

21 Tornillos de enfoque El macrométrico aproxima el enfoque El micrométrico consigue el enfoque correcto

22 Tipos de Microscopios

23 Contraste de Fases Permite ver células y tejidos sin teñir, o sea vivos Los materiales producen un retraso de fases en los rayos que los atraviesan Los cambios son ampliados y convertidos en cambios en la intensidad de luz Las células se observan en diferentes tonos de gris

24 Interferencia Permite ver células y tejidos sin teñir Se basa en los mismos principios que el contraste de fases Proporciona resultados cuantitativos e información sobre propiedades físicas de los materiales Detecta cambios en el índice de refracción de la luz, además de revelar las discontinuidades de fase

25 Fluorescencia Permite observar sustancias fluorescentes naturales o materiales teñidos Tiene alta sensibilidad, detecta la mínima cantidad de fluorescencia Las sustancias fluorescentes absorben luz de una longitud de onda y emiten luz de mayor longitud de onda Si se iluminan con luz azul o violeta (onda corta) emiten luz amarilla o verde (onda larga)

26 luz intensa (onda corta) filtro excitador material filtro supresor (pasa long. onda mayores) fondo oscuro y materiales brillantes

27 Microscopio Invertido Es una variante del microscopio común que tiene invertida la posición de los objetivos La luz de la fuente de iluminación llega desde encima de la platina Facilita el trabajo botellas o tubos de cultivo. Es usado en laboratorios de microbiología

28 Microscopio Confocal Utiliza iluminación láser y permite ver material grueso como secciones o cortes La imagen es captada por un detector que la transfiere a PC con analizador de imágenes

29 Microscopio Confocal

30 Microscopio Confocal 1. Constituye una herramienta ideal para examinar estructuras y funciones celulares. 2. Pueden observarse tejidos intactos o secciones gruesas sin necesidad de hacer cortes histológicos 3. Se obtiene un aumento notable en la resolución, con respecto a otros MO. 4. Permite hacer reconstrucciones en 3 dimensiones más precisas que con otros métodos.

31 Microscopio de Campo Oscuro Es un microscopio común cuyo sistema condensador está modificado para dirigir la luz desde los lados Sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible. La muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.

32 Microscopio de Campo Oscuro Permite ver partículas y células vivas que están debajo de la resolución del microscopio común Es usada en el estudio de pequeñas células móviles, que son invisibles con la microscopía óptica común.

33 Microscopio de Polarización similar al MO pero difiere en el agregado de dos filtros polarizadores de luz estos hacen que el fondo de la imagen sea oscuro y las estructuras observada aparezcan brillantes solamente se pueden ver las estructuras que son refringentes

34 Campo Claro Adecuado para analizar células y tejidos previamente fijados y coloreados Contraste de Fases Células y tejidos transparentes e incoloros de hasta 10 µm de espesor, que no pueden ser teñidos o no se desea teñir Interferencia Células y tejidos transparentes de algunos cientos de µm de espesor Campo Oscuro Materiales transparentes e incoloros que muestran poco contraste en campo claro (células, plancton, bacterias, cristales, esporas, polen, etc...) Fluorescencia Polarización Estudio de células o tejidos con fluorescencia propia o tratados con fluorocromos Materiales refringentes tales como colágeno, microtúbulos, quitina, celulosa, cristales, etc...

35 Breve historia de la Microscopía 1608 Janssen construye un microscopio con dos lentes convergentes (microscopio compuesto) Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe las células.

36 1674 Leeuwenhoek descubre los protozoarios W. Nicol desarrolla el microscopio con luz polarizada.

37 Breve historia de la Microscopía 1833 Brown describe el núcleo de la célula Schleiden y Schwann proponen la teoría celular Kolliker describe las mitocondrias en células musculares Flemming describe el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis en células animales Retzius describe la mayoría de los tejidos animales con un microscopio de luz Koch usa anilina para teñir e identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera Zeiss fabrica lentes que permiten resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible Golgi describe por primera vez el aparato de Golgi tiñendo células con nitrato de plata.

38 Breve historia de la Microscopía 1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia Zernike inventa el microscopio de contraste de fases Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, diseñan el primer microscopio electrónico Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz Aparece el microscopio de efecto túnel (MET).

39 Microscopio Electrónico

40 Microscopio Electrónico permite observar la ultraestructura de las células tiene un poder de resolución de 0,3 nm se basa en la propiedad de los haces electrones de ser desviados en un campo electromagnético la imagen se forma por la dispersión de los electrones que son desviados por el objeto observado la dispersión depende del espesor del objeto y del número atómico de los átomos que lo componen a mayor número atómico ocurre una mayor dispersión de electrones

41 Microscopio Electrónico de Transmisión en el MET el material a analizar debe ser fino, porque los electrones tienen escaso poder de penetración, usualmente entre 7 y 15 nm para ello la muestra es incluida en resinas de epoxi y se corta con un ultramicrótomo, equipado con una cuchilla de diamante, que permite hacer cortes de alrededor de 20 nm una sola célula bacteriana, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. para el estudio de las membranas celulares se emplea la técnica de congelación y fractura de las células. para superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono

42 Microscopio de Transmisión (MET)

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45 Microscopio Electrónico de Barrido a diferencia del MET, el MEB permite obtener imágenes tridimensionales de los objetos. en este caso un haz fino de electrones recorre la superficie del material. los electrones dispersados por el material son recogidos por una pantalla de video. para aumentar el poder dispersante de los electrones, suelen utilizarse sustancias químicas para revestir los materiales.

46 Microscopio de Barrido (MEB)

47 Leucoplastos Escherichia coli

48 Técnicas Cito-histológicas

49 son todos los procedimientos a través de los cuales una muestra se transforma en una preparación adecuada para estudio microscópico

50 Pasos de las Técnicas Citohistológicas 1. Obtención de la muestra 2. Fijación 3. Deshidratación 4. Inclusión 5. Cortes histológicos 6. Tinción 7. Montaje

51 1. Obtención de la muestra Para muestras obtenidas a partir de animales, este debe estar vivo y anestesiado. Los fragmentos deben ser pequeños, no mayores a 5 mm de espesor. Se deben cortar con un instrumento muy afilado. Luego de extraída, la muestra debe ser sumergida inmediatamente en fijador.

52 2. Fijación Es un método que permite conservar la morfología y composición de células y tejidos Consiste en matar a las células para que mantengan la estructura que poseían en vida Se debe realizar inmediatamente después de extraer la muestra para evitar el deterioro Los fragmentos de tejido deben ser lo más pequeño posible, para que el fijador penetre rápidamente. Tiene además la finalidad de endurecer los tejidos, volviéndolos resistentes para las etapas siguientes.

53 3. Deshidratación las piezas al ser retiradas del fijador están embebidas en agua ello impide que sean penetradas por la parafina en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos sin agua generalmente se utiliza una serie creciente de alcohol etílico

54 4. Inclusión Sirve para obtener cortes finos de tejido porque cuanto más firme más delgado será el corte. Lo más común es la inclusión en parafina, previo tratamiento con benceno o tolueno. Se emplean moldes de papel o de metal, dónde se coloca la muestra y se vierte la parafina a 60ºC. Se recortan los bloques en forma de pirámide cuadrangular y se adhieren a un taquito de madera

55 5. Cortes Histológicos Para observar tejidos en MO, se deben obtener láminas delgadas. En casi todos los casos el elemento utilizado para los cortes es el micrótomo. Son instrumentos de gran precisión que proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. Los cortes se extienden en agua tibia y se introduce el portaobjetos cubierto adhesivo.

56 6. Coloración o Tinción 1. Para obtener contraste y realizar observaciones morfológicas o estructurales. 2. Para identificar sustancias, moléculas o estructuras específicas.

57 Colorantes Naturales Animales (carmín) Vegetales (hematoxilina, orceína) Artificiales o Sintéticos Ácidos: sales con base incolora y ácido (eosina). coloreado Básicos: sales con base coloreada y ácido incoloro (azul de metileno). Neutros: sales en que el ácido y la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Indiferentes: no forman sales, tiñen sustancias que tienen poder mayor disolvente que el líquido en que están disueltas (Sudán lll, rojo escarlata).

58 7. Montaje Permite conservar las estructuras durante muchos años. Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo. La deshidratación se realiza con alcoholes la aclaración con xilol o alcohol. crecientes y Lo más común es efectuar la aclaración con xilol y luego montar la preparación en Bálsamo de Canadá. También es frecuente la aclaración en alcohol absoluto y el montaje en Euparal.