CURSO MICROSCOPÍA ÓPTICA Y LÁSER CONFOCAL SSTTI UA Octubre 2011 PRÁCTICA CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO DM IRE2

Transcripción

1 CURSO MICROSCOPÍA ÓPTICA Y LÁSER CONFOCAL SSTTI UA Octubre 2011 PRÁCTICA CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO DM IRE2 1

2 1. PARTES DEL MICROSCOPIO VISTA DESDE LA IZQUIERDA Detector de luz transmitida Columna de iluminación con luz transmitida Ocular Lente condensadora Platina galvanométrica Cubos de filtros de fluorescencia Rueda de foco Rueda de ajuste de la intensidad de la lámpara halógena Panel de control del microscopio 2

3 VISTA DESDE LA DERECHA Lámpara halógena (Luz transmitida) Filtros (vacío) Rueda de selección del detector de luz transmitida Torreta de la condensadora Lámpara de fluorescencia Revolver de los objetivos Módulo de las lentes de tubo (lente de Bertrand) Rueda de foco Movimiento x-y de la platina Posición torreta de condensadora Descripción Correspondencia con objetivos BF Vacío (Para campo claro) Todos Ph1 Anillo de fase Todos 20 Prisma condensadora DIC 20X 40/63 Prisma condensadora DIC 40X - 63X 100 Prisma condensadora DIC 100X 3

4 TORRETA DE LOS OBJETIVOS Torreta de los prismas DIC Revólver de los objetivos Diafragma de iluminación de epifluorescencia (Controla la intensidad de la iluminación) Diafragma de campo de epifluorescencia (Controla el área iluminada) Torreta de los cubos de filtros de fluorescencia Analizador (Luz polarizada y DIC) Posición torreta de los prismas DIC Descripción Correspondencia con objetivos BF Vacío (Para campo claro o contraste de fases) Todos C Prisma objetivo DIC 20X D Prisma objetivo DIC 100X E Prisma objetivo DIC 40X 63X 4

5 PANEL DE CONTROL DEL MICROSCOPIO Display LCD Botones del display LCD La luz roja indica el filtro de fluorescencia que está seleccionado Botones de cambio de filtros Botones de selección de la recogida de imagen: VIS = Ocular SIDE = Confocal BOTTOM = Vacío I3 N2.1 A Obturador de la lámpara de fluorescencia. Cuando está en rojo indica que el obturador está puesto y que no pasa luz Botones de cambio de las lentes del tubo El microscopio tiene tres cubos de filtros de fluorescencia: I3: excitación azul, BP ; emisión LP 515. Para FITC, Cy2, etc. N2.1: excitación verde, BP ; emisión LP 590. Para TRITC, Cy3, etc. A: excitación UV, BP ; emisión LP 425. Para AMCA, DAPI, etc. La posición SCAN se usa para imagen confocal y para la observación de luz transmitida a través de los oculares. 5

6 LCD DEL PANEL DE CONTROL DEL MICROSCOPIO Indica la posición z relativa al límite superior Indica el paso del foco fino. S0: el paso menor S3: el paso mayor Las flechas indican que se ha establecido un límite superior y/o inferior Modo seco = D Inmersión = I Cambio del paso de foco Objetivo en uso Prisma DIC requerido Prisma DIC en uso Bloque de fluorescencia No se debe presionar nunca el botón LEARN ya que se entraría en el modo de programación del microscopio. Si accidentalmente se presiona aparecerá parpadeando la opción EXIT. Se debe pulsar de nuevo LEARN para salir del modo de programación. El resto de botones, excepto STEP, tampoco se deben tocar. STEP se utilizará cada vez que sea necesario cambiar el paso del foco. 6

7 CAMBIO DE OBJETIVOS Para el cambio de objetivos se usan los botones de del lado izquierdo del microscopio. Botón superior para subir de aumentos Botón inferior para bajar de aumentos El objetivo que se está usando aparece en el LCD del panel de control. Objetivos secos: 10X y 20X Objetivos de inmersión en aceite: 40X, 63X, 100X Objetivo de inmersión en glicerina: 63X (naranja) Para evitar el riesgo de pasar accidentalmente de un objetivo de inmersión a uno seco el microscopio no permite hacer el cambio de forma automática usando los botones arriba indicados. Cuando se vaya a hacer un cambio entre objetivo seco y de inmersión o viceversa, se deberán pulsar simultáneamente los botones de límite superior e inferior del panel de control: Aparecerá entonces parpadeando CHANGE OBJECTIVE y ya se podrá cambiar de objetivo usando los botones de la parte izquierda del microscopio. 7

8 AJUSTE DE LA INTENSIDAD DE LA LUZ DE LA LÁMPARA HALÓGENA Se utiliza la rueda de la parte izquierda del microscopio: Cuando se ajusta la intensidad de la lámpara el voltaje utilizado se muestra automáticamente en el LCD del panel de control. Para apagar la iluminación de luz transmitida se gira el dial disminuyendo el voltaje hasta que aparezca 0 V. Para encenderla se gira en la dirección opuesta. ENFOQUE El foco se ajusta utilizando las ruedas a ambos lados del microscopio. También se puede ajustar con los botones de la parte derecha: Si se ha establecido un límite superior para el objetivo (estará indicado por una flecha en el display del LCD del panel de control) no se podrá mover el objetivo usando estos botones más allá de ese límite. Se usarán las ruedas de foco de los laterales. Es una medida de seguridad para evitar que accidentalmente se dañen los objetivos al subir usando estos botones. 8

9 El foco es electrónico y tiene cuatro pasos: S0 paso de foco fino S1 paso de foco medio S2 paso de foco medio-grueso S3 paso de foco grueso Se puede cambiar de un paso de foco a otro pulsando el botón STEP del panel de control. Cuando se selecciona un objetivo por primera vez la configuración por defecto es: 10X S3 20X S2 40X S1 63X S0 100X S0 9

10 2. AJUSTES PREVIOS COLOCACIÓN DEL PORTAOBJETOS CON LA MUESTRA El microscopio es invertido de modo que se colocará la muestra con el cubreobjetos boca abajo. El cubreobjetos debe tener un grosor de 0,17 mm para evitar aberraciones. Antes de colocar la muestra se debe bajar el objetivo usando los botones del lado derecho del microscopio. Se retiran los clips metálicos de la platina hacia los lados tal como se muestra en la imagen. Se coloca el portaobjetos (1) y se ajustan los clips sobre la muestra (2) AJUSTE DE LA DISTANCIA INTERPUPILAR Se ajusta la distancia interpupilar de los oculares juntándolos o separándolos lateralmente de forma que al mirar se observe un único círculo. 10

11 SELECCIÓN DEL DETECTOR DE LUZ TRANSMITIDA Para cualquier modo de observación de luz transmitida se coloca el botón en posición VIS. CONFIGURACIÓN PREVIA Se ajusta la cantidad de luz de la lámpara halógena con la rueda de la parte izquierda del microscopio. En la parte frontal del microscopio, donde pone MAG, se selecciona 1X. Se retiran el Polarizador y el Analizador. Se selecciona un objetivo de bajos aumentos y se comprueba que está en su posición de apertura numérica más abierta. Se seleccionan (manualmente) BF en la torreta de la condensadora y BF en los prismas de la torreta de los objetivos. Se enfoca la muestra. 11

12 3. OBSERVACIÓN EN CAMPO CLARO Observación en modo de luz transmitida sin utilizar ninguna técnica de aumento de contraste (ni contraste de fases ni interferencial ni luz polarizada) Se gira la torreta de la condensadora a la posición BF Se gira la torreta de los prismas DIC (bajo los objetivos) a la posición BF. Se selecciona en el panel de control la posición del filtro de fluorescencia SCAN (sin filtro). AJUSTE DE LA ILUMINACIÓN KÖHLER En una imagen microscópica, sólo puede reproducirse una zona determinada de una muestra (campo de imagen). La iluminación Köhler permite iluminar con precisión dicha zona. El fondo para la precisa iluminación del campo de imagen es el siguiente: Cuando la zona iluminada es menor que el campo de imagen, el cono de luz que percibe el objetivo y la apertura numérica también son menores. Dado que el poder resolutivo óptico depende directamente de la apertura numérica, al reducirse la iluminación también se reduce el poder resolutivo, lo cual no es deseable en la mayoría de los casos. Cuando la zona iluminada es mayor que el campo de imagen esto amplía la luz parásita. Esto, a su vez, conlleva una disminución del contraste de la imagen, lo que puede provocar que no se observen las estructuras de la imagen microscópica analizada ópticamente. La iluminación Köhler alcanza un punto intermedio entre el contraste máximo y el poder resolutivo máximo. Los objetivos de microscopios más potentes alcanzan con frecuencia su mejor comportamiento óptico sólo cuando la iluminación Köhler se ajusta con precisión Consiste en igualar el diámetro del diafragma de campo con el diámetro del campo de visión. 12

13 Diafragma de campo Rueda de foco de la condensadora Diafragma de apertura de la condensadora Tornillos de centrado 1. Abrir el diafragma de apertura de la condensadora, hacia la derecha. 2. Enfocar con nitidez una zona de la muestra que parezca interesante. Aún no es necesario tener en cuenta la calidad de la imagen. 3. Cerrar el diafragma de campo, hacia la izquierda. De esta forma se oscurecen la mayor parte de las zonas del campo de la imagen. Se ve un foco luminoso impreciso y desenfocado. Si este foco luminoso desaparece del campo de visión al cerrar el diafragma de campo, debe centrase éste último. En este caso, se abre el diafragma hasta que pueda ver el foco luminoso del borde del campo visual. En el caso de que no pueda ver el foco luminoso, es probable que la condensadora esté colocada a una altura incorrecta. En ese caso, se ajusta la altura de la condensadora hasta que se pueda ver el diafragma de campo. 13

14 4. Enfocar la imagen de la condensadora, es decir, el borde del foco luminoso, utilizando la rueda de foco de la condensadora hasta que la imagen de la apertura sea nítida. 5. Centrar en el campo visual el foco luminoso usando los tornillos de centrado. El centrado es más sencillo si se abre un poco el diafragma de campo para aumentar el tamaño del foco luminoso. 6. Abrir el diafragma de campo (hacia la derecha) justo hasta que desaparezca del campo de visión. 7. Cerrar el diafragma de apertura de la condensadora (hacia la izquierda) hasta que se alcance el contraste deseado. Si es necesario, bajar la intensidad de la luz con la rueda del lateral izquierdo del microscopio. Una apertura de condensadora muy cerrada aumenta el contraste pero disminuye la resolución, no se debe usar para graduar la cantidad de luz que recibe la muestra. La posición más adecuada suele ser 2/3 de apertura. El ajuste de la iluminación Köhler debe hacerse para cada objetivo. 14

15 4. OBSERVACIÓN EN LUZ POLARIZADA Útil en muestras que presenten anisotropía óptica. En primer lugar se hace el mismo ajuste que para la observación en campo claro y se retira la muestra. A continuación se introduce el filtro Polarizador cuidando de que la marca POL esté situada mirando hacia arriba. Se gira el porta-filtros hacia la derecha hasta introducirlo en el camino de la luz. Después se empuja el Analizador hasta la segunda posición de clic cuidando que la marca ICT mire hacia arriba. Se gira el Polarizador ligeramente hasta que se alcance la posición de extinción máxima (el campo lo más oscuro posible) con el campo de visión vacío, sin muestra. Por último se introduce la muestra. Puede ser necesario aumentar la intensidad de la lámpara halógena con la rueda de la parte inferior izquierda del microscopio. 15

16 5. OBSERVACIÓN EN CONTRASTE DE FASES Se necesita un objetivo de contraste de fases y un anillo de fases en la condensadora. Seleccionar el objetivo 10X. Realizar los mismos ajustes que para la observación de campo claro. Ajustar la iluminación Köhler. 1. Rotar la torreta de la condensadora y seleccionar el anillo Ph1. 2. Abrir el diafragma de apertura de la condensadora hasta al posición Ph. 2. Enfocar la muestra. 3. Insertar la lente de Bertrand en el camino óptico pulsando los botones de selección de las lentes de tubo de la parte frontal del microscopio hasta que se ilumine la posición B. 4. Enfocar el anillo de fase usando la rueda negra del módulo de las lentes de tubo. Lente de Bertrand (B) Rueda de enfoque 16

17 5. Centrar el anillo de fase de condensadora (el anillo negro) introduciendo las llaves de centrado en las aberturas que hay a derecha e izquierda de la etiqueta Ph1 en la torreta de la condensadora y manipulando hasta que coincidan los dos círculos. centrado 6. Retirar la lente de Bertrand seleccionando la posición 1X en la parte frontal del microscopio. Este ajuste hay que hacerlo para cada objetivo que se vaya a utilizar. 17

18 6. OBSERVACIÓN EN CONTRASTE INTERFERENCIAL (DIC) Se necesita un objetivo de contraste interferencial, un polarizador y un prisma DIC en la condensadora, y un analizador y otro prisma DIC después del objetivo. Seleccionar el objetivo 20X. Realizar los mismos ajustes que para la observación de campo claro. Ajustar la iluminación de Köhler y retirar la muestra. 1. Insertar el Polarizador y el Analizador tal como se indica en la observación con luz polarizada. 2. Insertar la muestra. 3. Seleccionar en la torreta de la condensadora el prisma correspondiente para el objetivo en uso. Posición torreta de condensadora Correspondencia con objetivos 20 20X 40/63 40X - 63X X 4. Seleccionar manualmente en la torreta de los objetivos el prisma correspondiente para el objetivo (C, D, E) según se requiere en el display LCD del panel frontal del microscopio. 5. Mover ligeramente a derecha e izquierda el prisma de la torreta de los objetivos para ajustar el contraste interferencial deseado. También se puede ajustar el contraste con el diafragma de apertura de la condensadora. 18

19 7. CAMBIO DE LA PLATINA GALVANOMÉTRICA El microscopio posee además de la platina galvanométrica dos platinas universales que pueden acomodar todo tipo de muestras. Para poder utilizarlas es necesario retirar previamente la platina galvanométrica. Antes de cualquier manipulación se debe retirar el objetivo hasta su posición más baja usando los botones de la parte derecha del microscopio. Para cambiar la platina se sueltan los tornillos que se indican en la imagen: La platina se dejará boca abajo sobre el cabezal de los láseres que hay a la izquierda del microscopio. Es muy importante no hacer presión sobre la platina cuando ésta está fuera del microscopio ya que el sistema galvanométrico se vería dañado. Se coloca la platina universal que se desee en el hueco que ha dejado la galvanométrica. Se debe tener precaución con no tocar el objetivo ni la superficie de la lente condensadora durante el cambio de la platina. 19

20 8. USO DE LOS OBJETIVOS DE INMERSIÓN APLICACIÓN DEL ACEITE DE INMERSIÓN 1. Limpiar el cubreobjetos de la muestra antes de utilizar un objetivo de inmersión. 2. Aplicar el aceite al objetivo o al cubreobjetos antes de colocar la muestra en la platina. 3. Utilizar solamente aceite de inmersión libre de fluorescencia. 4. Usar la mínima cantidad de aceite posible. Si se usa demasiado se extenderá por el lateral del objetivo pudiendo penetrar en la óptica y dañar irreversiblemente el objetivo y son extremadamente caros! 5. Sumergir el aplicador de la botella de aceite en el aceite. 6. Escurrir en los bordes de la botella de manera que se retire el exceso de aceite. 7. Aplicar el aceite tocando ligeramente sobre la parte metálica al lado de la lente, NUNCA TOCAR SOBRE LA LENTE. LIMPIEZA DEL ACEITE DE INMERSIÓN 1. Retirar la muestra de la platina. 2. Absorber el aceite sin restregar! con la toalla de Leica o con un papel de limpieza de objetivos. 3. Repetir esta operación tantas veces como sea necesario usando cada vez una parte diferente del papel o de la toalla. 4. Limpiar el metal de alrededor de la lente. Generalmente se requieren dos o tres papeles cada vez para dejar el objetivo libre de aceite. 5. Poner una gota de etanol en un papel nuevo o en la toalla de Leica y aplicar sobre el objetivo. 20