MATERIALES Y MÉTODOS. Muestras

Transcripción

1 MATERIALES Y MÉTODOS Muestras Las muestras de sangre con el bacilo M. tuberculosis se obtuvieron de 2 pacientes con tuberculosis diagnosticada por clínica, laboratorio y con cultivo positivo como controles positivos. Las muestras sanguíneas negativas se obtuvieron de tres personas sin ninguna sintomatología y signos de la enfermedad, presuntamente sanos. La toma fue por punción venosa, en tubos al vacío con EDTA, la muestras se guardaron a 4 C para su conservación. Extracción de ADN genómico Las muestras de sangre extraídas se dejaron a temperatura ambiente y se homogenizaron. Para la extracción de ADN se utilizó la técnica de GeneClean (BIO101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizaron distintas pruebas para la extracción del ADN de la muestra. Primeramente se probó la extracción del paquete de células blancas por la separación de células mononucleares, es decir de la capa de blancos en donde se tomaron los 5mL de sangre con EDTA contenida en el tubo, previamente homogenizada y se centrífugo a xg durante 10 minutos, tomándose toda la capa de mononucleares posibles. Por otro lado se probó la extracción a partir de sangre total, la sangre se homogenizó y se tomó directamente 3mL, ambas muestras se transfirieron a tubos eppendorf para realizar el proceso de extracción. Posteriormente a cada tuvo se les agregó solución de lisis (100mM NaCl, 50mM Tris, 10mM EDTA, 1% SDS) al tubo con capa de mononucleares 100 μl y al tubo con sangre total 500 μl, se homogenizaron por agitación con ayuda de pistilos y con vortex para lizar las células completamente, posteriormente se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después se sometieron a centrifugación por 10 minutos a xg y se recuperó el sobrenadante de cada una, se transfirieron a un tubo eppendorf 30

2 de 1.7mL conteniendo 150μL para el de las células mononucleares y en sobrenadante proveniente de sangre total con 350 μl de matriz GeneClean (BIO101) previamente agitada con el fin de que esté bien homogenizada; se dejaron reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente, se agitaron vigorosamente con vortex y se reposaron de nuevo, este paso se repitió dos veces mas y finalmente se dejaron en reposo por 3 minutos; se sometieron a centrifugación a xg por 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. A los precipitados se les agregaron 400 μl de solución de lavado procediendo después agitación con vortex, se centrifugaron de nuevo a g por 5 minutos, se eliminaron ambos sobrenadantes, los lavados se repitieron 3 veces más. Finalmente los pellet se dejaron secar al aire por inversión del tubo por 10 minutos, y se resuspendieron con 30μL de agua libre de nucleasas, se agitaron vigorosamente con vortex, centrifugándose a xg por 5 minutos y se recuperaron los sobrenadantes, se almacenaron a 20 C hasta su utilización (ver información detallada en anexo). El ADN extraído de las muestras se mandó a cuantificar para ver si la cantidad de ADN obtenido era suficiente para un buen rendimiento. Preparación del ADN purificado para PCR Las reacciones para PCR se realizaron a partir del DNA obtenido de los leucocitos (células mononucleares), usando el kit Ready To Go PCR (Invitrogen) siguiendo las indicaciones y condiciones del fabricante. Todas las reacciones para la amplificación para PCR se prepararon con H2O- estéril libre de nucleasa. Por 1 esfera de Ready To Go se agregaron 12 μl de agua libre de nucleasas, 1μL de mezcla de iniciadores a una concentración de 20mM y 2μL de DNA purificado para un volumen final de 15 μl de la mezcla reacción. 31

3 Estandarización de la Amplificación Las secuencias de los iniciadores usados para la amplificación conservada del ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis fueron los siguientes: LCP13Fw 5 CGTGAGGGCATCGAGGTGGC 3 y LCP13Rv 5 GCGTAGGCGTCGGT GACAAA 3 la cual es de 245 pb, se encuentra dentro del segmento de inserción IS6110 específico del complejo, y LCP11Fw 5 CAACTTCATCCACGTTCACC 3 y LCP11Rv 5 GAAGAGCCA AGGACAGGTAC 3 el cual es un fragmento de la secuencia de cadenas β globina de 268 pb utilizada como control interno de amplificación para TB. Para el proceso de amplificación se utilizó un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). Se siguió el protocolo recomendado por el fabricante, el cual consistió en resuspender una esfera de Ready to Go a un volumen final de 25 μl para obtener una mezcla de amplificación con las siguientes concentraciones de 2.5 unidades de PuReTaq polimerasa, de cada dntp 200μM en 10mM Tris-HCL, 50mM de KCl y 1.5 mm de MgCl 2. y agregarle posteriormente los iniciadores y el DNA purificado a las concentraciones y cantidades ya mencionadas anteriormente. El ADN extraído y purificado del bacilo en sangre periférica se amplificó primeramente con el protocolo recomendado por los Laboratorios Clínicos de Puebla el cual se tomó como referencia, así como un segundo protocolo proporcionado por el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste CIBNOR, S.C., ambos se probaron con los ADN purificados tanto positivos como negativos. Las condiciones de amplificación proporcionadas por el protocolo utilizado en Puebla fueron las siguientes: un primer ciclo de desnaturalización de 95 C por 15 minutos, continuando con 40 ciclos: desnaturalización a 94 C por 15 segundos, alineamiento a 67 C por 20 segundos, una elongación a 72 C por 30 segundos y una extensión final a 72 C por 2 minutos. Las condiciones de amplificación otorgadas y sugeridas por CIBNOR consistieron en un ciclo de desnaturalización a 95 C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos: desnaturalización 32

4 a 94 C por 30 segundos, alineamiento a 60 C por 30 segundos, una elongación a 72 C por 60 segundos y finalmente un ciclo de extensión a 72 C por 7 minutos. En base a las condiciones antes mencionadas se realizaron distintas amplificaciones con gradientes en la temperatura de alineación variando las temperaturas desde 60 a 69 C con +0.5 C de aumento, se realizaron distintas pruebas con modificación en el número de ciclos en un rango de 30 como mínimo y a 40 como máximo, así también se probaron distintas modificaciones en los tiempos de cada ciclo. Para el proceso de estandarización se utilizó un control interno de amplificación el iniciador LCP11-Fw y LCP11-Rv (Laboratorios Clínicos Puebla). Una ves que se encontraron las condiciones de amplificación óptimas para el complejo M. tuberculosis se analizaron las corridas de los ADN purificados de pacientes tanto positivos como negativos. Dentro del proceso de estandarización se realizó la extracción y purificación del bacilo proveniente de una muestra de esputo, con el fin de probar las condiciones encontradas como óptimas y corroborar dichas condiciones de amplificación, así tener a su ves un ADN del bacilo puro como control positivo. Teniéndose así un patrón a comparar y a parte poder contar con un protocolo para muestras de expectoración como un aporte adicional a dicho protocolo de diagnóstico (ver en anexo), también se realizó el proceso de extracción y purificación de la cepa H37Rv control positivo, ya que es la cepa estándar de oro dentro de las pruebas de diagnóstico para la tuberculosis. Identificación de los productos de PCR Los productos obtenidos por PCR se analizaron por electroforesis en geles adquiridos comercialmente de agarosa al (2 %) y (4%) ya preparados con bromuro de etidio, se siguieron las indicaciones y condiciones de uso por el fabricante, siendo las siguientes: El gel se pre-corrió antes de su uso, es decir se colocó en la cámara de voltaje por un periodo de tiempo de 2 minutos, para analizar el producto de las reacciones de PCR se tomaron 10uL del producto amplificado y, los geles se corrieron de 15 a 30 33

5 minutos como máximo. Para determinar el tamaño de los fragmentos se utilizó el marcador de peso molecular de Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) el cual se utilizó a una concentración de 1:10, colocándose por carril 10μL. Las bandas se visualizaron en un transiluminador UV, la imagen del patrón de bandeo se observó y analizó por un sistema de software, se capturó y almacenó la imagen en fotografía digital con cámara EL LOGIC 100 imaging system (Kodak, Rochester, NY). Análisis de Restricción en productos de PCR Los productos de amplificación del DNA en sangre y expectoración TB positivos que codifican para el segmento de inserción IS6110 específico del complejo Mycobacterium tuberculosis se digirieron con la enzima de restricción SacII mezclando 9 μl de ADN de muestra con 5 U de enzima e incubando por 2 hr a 42 C. La enzima SacII corta solamente en un sitio de la secuencia del segmento IS6110 obteniendo dos fragmentos de 190 y 55 pb a partir del producto de 245 pb obtenido en la amplificación con los iniciadores LCP13-Fw y LCP13-Rv. Los productos de las digestiones se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 4% ya preparados con bromuro de etidio, se identificaron y analizaron las bandas obtenidas. 34