Construcción de la biblioteca en cósmidos de Azospirillum brasilense CBG 497.

Transcripción

1 Construcción de la biblioteca en cósmidos de Azospirillum brasilense CBG 497. Extracción de DNA genómico El DNA de A. brasilense CBG 497 se extrajo siguiendo el método descrito por la casa comercial distribuidora del estuche Wizard Genomic DNA Purification Kit, el cual se describe a continuación: Transferir a un tubo Eppendorf de 1 a 1.5 ml de cultivo. Centrifugar 3 min a 13,000 rpm (Microcentrífuga Hermle modelo Z-160 MH). Agregar 600 µl de Nuclei Lysis Solution y mezclar pipeteando suavemente. Incubar por 15 min a 80 C en un Thermomixer (Eppendorf, modelo 2331). Enfriar a temperatura ambiente para agregar de 2 a 3 µl de solución de RNasa. Mezclar e incubar por 60 min a 37 C. Posteriormente enfriar a temperatura ambiente y agregar 200 µl de Protein precipitation solution, agitar en vortex (Daigger & Co., Inc, modelo G-560) e incubar en hielo durante 5 min. Centrifugar por 3 min a 13,000 rpm y transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo y agregar 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente mezclando vigorosamente. Seguido a esto, centrifugar a 13,000 rpm por 3 min y se decantar el sobrenadante. Adicionar 600 µl de etanol al 70 % a temperatura ambiente para lavar el precipitado de DNA y mezclar por inversión. Centrifugar a 13,000 rpm por 2 min. Decantar el etanol y secar el precipitado de DNA en centrífuga de vacío por 10 min. Finalmente rehidratar el DNA con 50 µl de DNA Rehydration solution e incubar por 1 h a 65 C o toda la noche a temperatura ambiente. La calidad y cantidad del DNA se calcula midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm y de 280 nm. Para calcular la cantidad se utiliza la ecuación: Concentración (µg/ml)= (factor de conversión)(factor de dilución)(absorbancia a 260 nm) donde factor de dilución= (vol. agua estéril) + (volumen de muestra)/(volumen de muestra) factor de conversión= 50 µg/ml Alternativamente, se realizó extracción de DNA cromosomal por el método descrito por Sambrook para evaluar cual de las dos metodologías proporciona DNA en mayor cantidad y de mayor calidad, siendo ambos métodos efectivos para el fin propuesto. El protocolo se describe a continuación: Depositar 5 ml del cultivo en un tubo falcon de 50 ml, precipitar centrifugando 5 min a 3800 rpm en centrífuga Beckman Coulter Allegra TM 6R. Desechar el sobrenadante. Resuspender la pastilla con 10 ml de solución TES (Tris 0.1 mm, NaCl 5 mm y EDTA mm), incubar 5 min

2 a temperatura ambiente. Agregar 8 ml de SDS 10% y mezclar suavemente. Añadir 6 ml de Acetato de sodio 3M y mezclar fuertemente. Aforar el tubo falcon de 50 ml con isopropanol y ver por inversión la masa de DNA, tomarla con una pipeta Pasteur y depositarla en un vaso que contenga etanol puro. Después de lavar la pastilla con etanol, pasar la pastilla a un tubo Eppendorf estéril y secar. Ya seco, agregar 1.5 ml de agua estéril precalentada a 65 C. Incubar a 42 C toda la noche para permitir la disolución. CONSTRUCCIÓN DE LA BIBLIOTECA. 1. Preparación del DNA a insertar Se analizó el tamaño de los fragmentos del DNA extraído mediante un gel de electroforesis en campos pulsados (PFGE) con las siguientes condiciones: Rango de tamaño a separar: 5-75 kb Agarosa: 1% Temperatura: 14 C Tiempo de cambio en la corriente: 1-6 seg. Tiempo de corrimiento: 11 hs. Gradiente de voltaje: 6 V/cm. Se utilizó como marcador el DNA control de cósmido de 36 kb para discriminar los fragmentos de interés.

3 Se fragmentó el DNA de las muestras que mostraron un rango de fragmentos de mayor tamaño al marcador, haciendo pasar el DNA a través de la punta de una pipeta de 200 µl alrededor de 100 veces, y se corrió nuevamente el gel de PFGE con las condiciones antes descritas.

4 2. Reacción de reparación de los extremos del DNA a insertar Se combinaron en hielo los siguientes reactivos: 8 µl de Buffer 10X de reparación de los extremos 8 µl de 2.5 mm de la mezcla de dntps 8 µl de ATP 10 mm x µl de agua estéril 20 mg del DNA a insertar 4 µl de la mezcla de enzimas para la reparación de los extremos 80 µl volumen total de reacción Se incubó a temperatura ambiente por 45 min, y posteriormente 10 min a 70 C para inactivar la enzima. 3. Selección del DNA a insertar por tamaño Los fragmentos se separaron en un gel de PFGE con las condiciones antes descritas, en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% con buffer TAE 1X (acetato de Tris [ph8] 40mM, EDTA 1 mm). Se utiliza como marcador a ambos lados el DNA control de cósmido de 36 kb, y se escinden las bandas con los fragmentos del tamaño deseado y se almacenan en tubos Eppendorf de 1.5 ml. 4. Recuperación del DNA de interés Determinar el volumen de agarosa. Derretir la agarosa incubando a 70 C de 10 a 15 min. Transferir el tubo a 45 C. Agregar el buffer GELase 50x precalentado a 45 C hasta una concentración final de 1x. Añadir 1 U de la preparación de enzima GELase por cada 100 µl de agarosa y mezclar suavemente. Incubar a 45 C por lo menos una hora. Transferir la reacción a 70 C por 10 min para inactivar la enzima. Depositar alícuotas de 500 µl en tubos de 1.5 ml estériles, incubar en hielo por 5 min y centrifugar a máxima velocidad por 20 min. Transferir el 90-95% del sobrenadante (DNA) a un tubo estéril de 1.5 ml. Para precipitar el DNA Adicionar 1/10 de volumen de Acetato de sodio 3 M (ph7). Mezclar suavemente. Añadir 2.5 volúmenes de etanol. Mezclar por inversión. Centrifugar 20 min a velocidad máxima. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente. Lavar la pastilla 2X con etanol al 70% frío. Invertir el tubo y secar 5-10 min. Resuspender el DNA con TE y determinar su concentración por fluorimetría. En este caso no fue un resultado muy confiable, y se calculó la concentración corriendo una

5 cantidad del DNA en gel de agarosa al 1% con una serie de estándares de concentraciones conocidas. 5. Reacción de ligación Se combinaron los siguientes reactivos en el orden listado y mezclar después de cada adición: 1 µl de agua estéril 1 µl Buffer de Ligación Fast-Link 10X 1 µl ATP 10 mm 1 µl pweb Vector (0.5 mg/ml) 5 µl DNA a insertar concentrado (0.25 mg of»40 kb DNA) 1 µl DNA Ligasa Fast-Link 10 µl Volumen total de reacción Se incubó a temperatura ambiente durante 2 hs. Se transfirió la reacción a 70 C por diez minutos para inactivar la ligasa. 6. Empaquetamiento in vitro Inocular 50 ml LB + MgSO 10 mm y maltosa 0.2% con una colonia EPI 100 TIR. Incubar toda la noche a 37 C. Inocular 50 ml LB suplementado con 5 ml de este cultivo. Incubar en agitación a 37 C hasta obtener una O.D. = Almacenar a 4 C hasta 72 hrs. Descongelar un extracto de empaquetamiento a temperatura ambiente. Transferir 25 µl de este a un tubo de 1.5 ml y colocar en hielo. Agregar el volumen total de la ligación, mezclar con pipeta, evitando la formación de burbujas e incubar a 30 C durante 90 min. Adicionar los 25 µl restantes del extracto e incubar nuevamente a 30 C durante 90 min. Añadir 500 µl del buffer de dilución del fago, mezclar vigorosamente en el vortex. Agregar 25 µl de cloroformo y mezclar nuevamente en el vortex. Adicionar 10µL de los cósmidos empacados a 100 µl de las células huésped EPI 100 T1. Permitir la adsorción durante 10 min a 37 C. Sembrar en placas de medio LB con ampicilina e incubar a 37 C durante toda la noche. Contar las colonias y calcular el título. Calcular el número total clonas en la biblioteca (título x volumen total). Determinar si es un número suficiente de clonas de acuerdo a la siguiente ecuación: donde N = ln (1-P ) / ln (1-f )

6 P= probabilidad de encontrar representado todo el genoma en la biblioteca expresada en valor fraccionario f= cociente de (tamaño de los insertos aceptados en las clonas)/(tamaño del genoma) N= ln (1-0.99)/ln [1-(4x10 bases/7.2x10 bases)] clonas son necesarias para tener representado el genoma de A. brasilense en la biblioteca. Actividades a realizar: Infectar E. coli con los fagos para transferir los cosmidos conteniendo los insertos del genoma de A. brasilense. Realizar ensayos deverifiacai[on de la calidad del banco genómico mediante exposición a luz UV para detectar la presencia delos gens reca.