RapidFinder STEC Detection Workflow

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Carla Robles Cruz
hace 8 años
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1 QUICK REFERENCE RapidFinder STEC Detection Workflow Aislamiento automático de ADN y detección de la PCR en tiempo real de E. coli O157:H7 y cepas "Big 6" de STEC no O157 Número de catálogo , , , N.º de pub. MAN Rev. A.0 Nota: Si desea conocer las recomendaciones de seguridad y riesgos biológicos, consulte el anexo Seguridad en el documento RapidFinder Shiga Toxin-Producing E. coli (STEC) Detection Workflow User Guide (Pub. no ). Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, guantes). Esta referencia rápida se ha diseñado para usuarios expertos del RapidFinder STEC Detection Workflow. Consulte la RapidFinder Métodos Preparación de las muestras de alimentos Shiga Toxin-Producing E. coli (STEC) Detection Workflow User Guide (Pub. no ) para obtener la siguiente información: Directrices importantes sobre el procedimiento Instrucciones detalladas Solución de problemas 1 Homogeneización y enriquecimiento de las muestras de alimentos Incubar a 42±1 C 375 g de carne picada/recortes +1 l de TSB (precalentado a 48±1 C) 10 horas como mínimo Muestra enriquecida Aislamiento del ADN con el PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit 2 Preparación de Binding Solution y Wash Buffer Prepare estos reactivos antes de usar por primera vez un nuevo PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit. 35 ml 74 ml, mezclar Isopropanol al 100 % Etanol al 95 % Binding Solution Wash Buffer 3 Preparación de los reactivos a. Prepare el Proteinase K Buffer Mix, mezcle bien y almacénelo con hielo hasta que esté listo para su uso. Componente Volumen por extracción Volumen para n extracciones [1] Proteinase K 10 µl 200 µl 10 µl 11 µl n PK Buffer 200 µl 220 µl n Volumen total por extracción 210 µl 231 µl n PK Buffer Proteinase K Buffer Mix Proteinase K [1] Incluye un 10 % de excedente. Para analizar muestras ambientales y de alimentos solamente.

2 3 Preparación de los reactivos (cont.) b. Justo antes de su uso, prepare el Binding Mix y agítelo durante 10 segundos aproximadamente. Componente Volumen por extracción Volumen para n extracciones [1] Binding Solution (isopropanol) Magnetic Particles precalentadas a 37±1 C y completamente resuspendidas Volumen total por extracción [1] Incluye un 10 % de excedente. 325 µl 25 µl 325 µl 357,5 µl n 25 µl 27,5 µl n 350 µl Magnetic Particles 385 µl n 37±1 C, agitar Binding Mix Binding Solution 4 Preparación de la placa de lisis 210 µl 200 µl a b Proteinase K Buffer Mix PLACA DE LISIS (MagMAX Express-96 Deep Well Plate) Muestra enriquecida 5 Preparación de las placas de procesamiento MagMAX Express-96 Peine para muestras con puntas Elution Buffer 300 µl Wash Buffer 300 µl 140 µl PEINE PARA MUESTRAS CON PUNTAS PLACA DE ELUCIÓN PLACA DE LAVADO 1 PLACA DE LAVADO 2 2 Referencia rápida de RapidFinder STEC Detection Workflow (aislamiento automático de ADN)

3 6 Procesamiento de las muestras en el instrumento MagMAX Express-96 PEINE PARA MUESTRAS CON PUNTAS MagMAX Express-96 a Seleccionar _PrepSEQ_STEC. Pulse Start (Iniciar). b PLACA DE ELUCIÓN PLACA DE LAVADO 1 PLACA DE LAVADO 2 PLACA DE LISIS Cargue las placas de acuerdo con la lectura del instrumento e inicie el proceso. 350 µl 200 µl Enjoy your DNA (Disfrute de su ADN) Lysis Buffer PLACA DE LISIS 10 min c Binding Mix 2 min PLACA DE ELUCIÓN PLACA DE LISIS d 30 min e PUNTO DE PARADA (opcional) Selle la placa y almacene el ADN: A 5±3 C durante un máximo de 24 horas. Por debajo de 18 C para un almacenamiento a largo plazo. Realización de la PCR con el RapidFinder Ensayo de cribado de STEC 7 8 Creación o edición del archivo de ejecución en RapidFinder Express Software Siga las instrucciones de los mensajes del software. Preparación de las microesferas del ensayo Según la disposición de la placa determinada por el RapidFinder Express Software, coloque las tiras de tubos con las microesferas del ensayo o vacíe las MicroAmp Fast 8 Tube Strips en una base de 96 pocillos a temperatura ambiente (23±5 C). Cribado STEC BASE DE 96 POCILLOS Referencia rápida de RapidFinder STEC Detection Workflow (aislamiento automático de ADN) 3

9 Preparación de las reacciones de la PCR Siga y mantenga la disposición de la placa determinada por el software mientras prepara las reacciones de la PCR.

Repetir b 10 Carga y ejecución de las reacciones Siga las instrucciones de los mensajes del software.

4 9 Preparación de las reacciones de la PCR Siga y mantenga la disposición de la placa determinada por el software mientras prepara las reacciones de la PCR. 30 µl temperatura ambiente PLACA DE ELUCIÓN a BASE DE 96 POCILLOS 1. Agitar a velocidad elevada de 5 a 10 segundos 2. Centrifugar a g durante 30 segundos 3. Repetir b 10 Carga y ejecución de las reacciones Siga las instrucciones de los mensajes del software. 11 Visualización de los resultados del ensayo de cribado Realización de la PCR con el RapidFinder Ensayo de confirmación de STEC 12 Preparación y ejecución del ensayo de confirmación de STEC El procedimiento de PCR en tiempo real es idéntico al del ensayo de cribado, a excepción de la selección del ensayo. Confirmación STEC 4 Referencia rápida de RapidFinder STEC Detection Workflow (aislamiento automático de ADN)

13 Visualización, impresión y exportación de los resultados del ensayo de confirmación de STEC Imprima o exporte los resultados desde la pestaña Reports (Informes) de la página View Results (Ver

5 13 Visualización, impresión y exportación de los resultados del ensayo de confirmación de STEC Imprima o exporte los resultados desde la pestaña Reports (Informes) de la página View Results (Ver resultados). Para obtener más información acerca del análisis de los datos, consulte: La guía de usuario de su instrumento. La ayuda en línea de RapidFinder Express Software. RapidFinder Shiga Toxin-Producing E. coli (STEC) Detection Workflow User Guide. Métodos de confirmación independientes USDA FSIS MLG 5.08 e ISO 16654:2001 son protocolos aprobados para la confirmación de E. coli O157:H7 y E. coli O157 respectivamente. Se pueden usar los ensayos TaqMan mostrados en las tablas siguientes para distinguir entre los serogrupos de las muestras cuyo resultado se determine positivo según el RapidFinder Ensayo de confirmación de STEC. Tabla 1 Ensayos TaqMan STEC (diseño ISO) Ensayo [1] Cat. no. Ensayo TaqMan STEC 045 y Ensayo TaqMan STEC 026, 0103 y Ensayo TaqMan STEC 0111 y [1] Siga las directrices ISO/TS 13136:2012. Historial de revisiones Revisión Fecha Descripción A.0 Noviembre de 2014 Documento nuevo. Referencia rápida para usuarios expertos. Limited product warranty Life Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant their products as set forth in the Life Technologies' General Terms and Conditions of Sale found on Life Technologies' website at If you have any questions, please contact Life Technologies at Tabla 2 Ensayos TaqMan STEC (diseño MLG) Ensayo [1] Cat. no. TaqMan STEC O103 y O TaqMan STEC O26 y O TaqMan STEC O45 y O [1] Siga las directrices USDA FSIS MLG 5B (no O157). Referencia rápida de RapidFinder STEC Detection Workflow (aislamiento automático de ADN) 5

6 Translated from the English Publication Number MAN Rev. A. La información contenida en esta guía está sujeta a cambios sin previo aviso. DISCLAIMER LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND/OR ITS AFFILIATE(S) DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE, OR NON-INFRINGEMENT. TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. Todas las marcas comerciales son propiedad de Thermo Fisher Scientific y sus subsidiarias salvo que se especifique lo contrario. Si necesita soporte técnico, visite lifetechnologies.com/support or techsupport@lifetech.com lifetechnologies.com 20 Abril 2015

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