Material complementario UD 5
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- Gonzalo Aguilera Suárez
- hace 7 años
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1 Material complementario UD 5
2 Componentes de la PCR ADN molde que es el que se quiere replicar. Oligonucleótidos iniciadores, primers o cebadores: - Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. - La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja. - Concentraciones finales de nM de cada cebador suelen dar buenos resultados - Se diseñan por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés pero en extremos y cadenas opuestas: CEBADOR FORWARD = SE UNE A LA HEBRA 3-5 CEBADOR REVERSE = SE UNE A LA HEBRA 5-3.
3 - Un juego de cebadores define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se amplificará y que será la comprendida entre ambos. - Los cebadores fijan la especificidad de la reacción, haciendo posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas.
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5 Diseño de cebadores Es necesario conocer la secuencia de bases de las dos regiones que flanquean el fragmento a amplificar. Requisitos diseño de cebadores: LONGITUD: bases. Tamaño mínimo 16 bases. Cebadores menores carecen de especificidad y son responsables de productos amplificados no específicos. Cebadores superiores a 30 bases dan especificidad a la técnica pero se unen peor a la cadena molde y disminuyen el rendimiento de la reacción. En situaciones concretas se usan cebadores de bases. COMPOSICIÓN: mejores resultados con cebadores con G+C entre 40-60%. Distribución de dominios ricos en A/T y G/C equilibrada. SECUENCIA: no deben contener secuencias complementarias: INTRAMOLECULARES: Puede dar lugar a la formación de estructuras secundarias en el cebador (horquillas) que impidan su unión al ADN molde. INTERMOLECULARES: se forman dímeros que bloquean la unión a la cadena molde. TEMPERATURA DE FUSIÓN: Tm = 52-65ºC. La diferencia de Tm entre cebadores debe ser inferior a 5ºC. Actualmente existen programas informáticos que diseñan los primers
6 Desoxirribonucleótidos trifosfatados o dntps (datp, dctp, dgtp, dttp). - Los cuatro dntps deben estar presentes en la misma concentración 10mM (2,5 mm por cada dntp). - Concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dntp es de 200µM. Cloruro de magnesio (MgCl 2 ), factor importante para la optimización de la reacción. La ausencia o una concentración baja de Mg 2+ determina la inactividad de la enzima. Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación. Cada enzima tiene una concentración óptima de Mg2+. Concentración final estándar para la TAQ polimerasa es de 1,5mM. Agua libre de ADNasas y ARNasas. Buffer para mantener el ph: alrededor de 8,3 ADN polimerasa termoestable: Taq polimerasa: actuación 75-80ºC y resistencia 2 horas a 93ºC Se suelen suministrar concentradas en soluciones 50% de glicerol y los fabricantes indican su concentración óptima. Concentración óptima = 1-2,5 unidades para un vol de reacción final de 50 µl.
7 Se usan cuando: Aditivos El rendimiento es bajo. Cuando aparecen amplificados productos no deseados. Presencia de contaminantes.
8 Preparación máster mix Las reacciones de PCR se realizan en volúmenes muy pequeños. Los componentes se suministran concentrados. Las cantidades que se van a pipetear de cada uno de ellos son muy pequeñas 0,5 y 5 µl. La posibilidad de errores en el pipeteado es muy elevada.
9 Se realizan cálculos por lo que los posibles errores cometidos en cada tubo son distintos. Para evitar esto se prepara una única mezcla de reacción master mix que contiene todos los reactivos menos el ADN molde. La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el nº de muestras +1, incluyendo los controles. Una vez completada la master se reparte la cantidad adecuada en cada tubo.
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11 REALIZAR PCR EN EL TERMOCICLADOR 1.Preparar la máster mix: ajustar los volúmenes según el número de pruebas. 2. Preparar los tubos: no olvidar el control positivo y el control negativo. 3. Añadir master mix a cada tubo y posteriormente el ADN molde 4. Poner los tubos en el termociclador 5. Programar el termociclador
12 Programar el termociclador Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación. Fases: Desnaturalización inicial Ciclos de replicación Extensión final Mantenimiento
13 DESNATURALIZACIÓN INICIAL Etapa inicial. Calentar la mezcla de reacción a 94-95ºC durante varios minutos. Desnaturalización completa de todas las moléculas bicatenarias
14 CICLOS DE REPLICACIÓN Se programan: Temperaturas y tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico: Desnaturalización. Hibridación de los cebadores. Extensión. Nº de veces que se va a repetir el ciclo (depende del nº inicial de copias que se quieran amplificar). Cuanto más abundante sea el fragmento que se quiere amplificar menor nº de ciclos. Nº de ciclos oscila entre 25 y 35. Casos difíciles 40
15 EXTENSIÓN FINAL Incubación única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos. Todos los productos de PCR deben estar completos y en forma de doble hélice.
16 MANTENIMIENTO La programación del termociclador finaliza con una última incubación a 4ºC sin límite del tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del termociclador. Se anula la actividad de la enzima.
17 CEBADORES PCR ANIDADA Los cebadores usados en ambas PCR son distintos: C. Externos: se utilizan en la primera PCR y están diseñados para amplificar un fragmento de mayor longitud que la región de interés. C. Internos: se utilizan en la segunda PCR y están diseñados para amplificar la región de interés e hibridar en el interior del fragmento amplificado en la primera PCR.
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