REF : IMG-116. Cuantificación de polimorfismos en quimeras hematopoyéticas mediante PCR a tiempo real INNOVACIÓN TECNOLÓGICA PARA LABORATORIO

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Daniel Espejo Quintero
hace 5 años
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1 Cuantificación de polimorfismos en quimeras hematopoyéticas mediante PCR a tiempo real REF : IMG-116 imegen.es INNOVACIÓN TECNOLÓGICA PARA LABORATORIO Rev. 5

2 imegen.es 2

3 imegen.es 3

4 β imegen.es 4

5 Recepción de muestras Extracción de ADN Genotipado para la detección de alelos informativos Identificación específica de alelos imegen Screening I y II, imegen QScreening Multiplex I REF: IMG IMG IMG Cuantificación relativa de los alelos Análisis del estado de los Quimerismos imegen Quimera (REF: Tabla 1) Imagen 1. Protocolo de trabajo para la detección y cuantificación de polimorfismos informativos imegen.es 5

6 imegen.es 6

7 β imegen.es 7

8 INDELs Inserción (Alelo +) Deleción (Alelo -) Referencia del kit SRY X IMG Q116-3I X IMG Q116-4I X IMG Q116-5I X IMG Q116-6I X IMG Q116-7I X IMG Q116-8I X IMG Q116-9I X IMG Q116-10I X IMG Q116-11I X IMG Q116-12I X IMG Q116-4D X IMG Q116-5D X IMG Q116-10D X IMG RhD X IMG Q116-20I X IMG Q116-12D X IMG Q116-23I X IMG Tabla 1. Referencias del kit imegen-quimera imegen.es 8

9 Reactivos Viales Conservación Máster-Polimorfismo Máster-β-globina Control positivo 25 reacciones 25 reacciones 25 reacciones 4ºC 4ºC 4ºC Tabla 2. Componentes del kit imegen-quimera imegen.es 9

10 : Equipos 1 Termociclador de PCR a tiempo real 2 Micropipetas (10 µl, 20 µl y 200 µl) 3 Vórtex Materiales 1 Tubos ópticos de 0,2 ml 2 Tapas ópticas para tubos de 0,2 ml 3 Puntas de pipetas con filtro (10 µl, 20 µl y 200 µl) 4 Tubos estériles de 1.5 ml 5 Guantes de látex sin polvo imegen.es 10

11 Reactivos Máster-Polimorfismo Máster-β-globina Control positivo Rehidratación 80 μl de agua/vial* 80 μl de agua/vial* 100 μl de agua/vial* Tabla 3. Volumen de rehidratación de los reactivos del kit imegen.es 11

12 β β β Reactivos Máster-β-globina o polimorfismo Máster-Mix PCR 2x Volumen por reacción 3 L 5 L Tabla 4. Cantidad de reactivos necesaria por reacción imegen.es 12

13 Reactivos Máster-β-globina o polimorfismo Máster-Mix PCR 2x ADN Volumen por reacción 5 L 7 L 10 L Tabla 5. Cantidad de reactivos necesaria por reacción para muestras poco concentradas Sonda Receptor Emisor o Quencher β-globina FAM TM TAMRA* Polimorfismo informativo FAM TM TAMRA* (MGB para la referencia IMG ). Tabla 6. Información de las sondas imegen.es 13

14 Campos Etapa 1 Activación enzimática Nº de Ciclos 1 ciclo inicial Desnaturalización Etapa 2 PCR 50 ciclos Unión de oligonucleótidos / Extensión Temperatura 95ºC 95ºC 58ºC Tiempo 10 minutos 15 segundos 1 minuto* Tabla 7. Programa de PCR óptimo para el 7500 FAST o StepOne Campos Etapa 1 Activación enzimática Etapa 2 PCR Etapa 3 Nº de Ciclos 1 ciclo inicial Desnaturalización 50 ciclos Unión de cebadores Extensión 1 ciclo final Temperatura 95ºC 95ºC 58ºC 72ºC 40ºC Tiempo 10 minutos 5 segundos 10 segundos 15 segundos* 20 segundos Tabla 8. Programa de PCR óptimo para Lightcycler 480 imegen.es 14

15 β β β % Quimera = (E Ct diana (calibr. muestra) diana) x 100 Ct ref (calibr. muestra) (E ref ) β imegen.es 15

16 imegen.es 16

17 www. rafer. es Barcelona Bilbao La Coruña Madrid Málaga Sevilla Valencia Zaragoza Lisboa

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