EVALUACION EXTERNA DEL DESEMPEÑO PARA LA DETECCION DEL VIRUS DE INFLUENZA TIPO A MEDIANTE LA TÉCNICA DE RT- PCR PANEL x (20xx)

Transcripción

1 1. OBJETIVO Evaluar el desempeño de los Laboratorios de Salud Pública participantes en cuanto a la detección del virus de la Influenza A mediante la técnica de RT PCR. 2. ALCANCE Este documento se tomo como referencia para la evaluación de los Laboratorios de Salud Pública participantes con relación al procedimiento de detección del virus de Influenza A. 3. RESPONSABILIDAD Es responsabilidad de los profesionales del Laboratorio realizar el procedimiento establecido de la evaluación externa del desempeño directa y su respectiva respuesta según lo establecido por el - INS. 4. DEFINICIONES Evaluación directa: Es el proceso de verificación, análisis y valoración que se realiza a un programa, a cargo de una entidad externa evaluadora que cuente con autorización vigente emitida por el órgano operador correspondiente. Calidad: Es el cumplimiento de todos los requisitos solicitados ya sea de un producto o servicio en vías de satisfacer una necesidad del cliente. Infección Respiratoria Aguda (IRA): Es toda infección que compromete una o más partes del aparato respiratorio, durante un lapso no mayor a 15 días. La mayoría se deben a virus. RT-PCR: Siglas de término en ingles Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction to real. Comprende una serie de reacciones enzimáticas independientes, en las cuales inicialmente se realiza la síntesis de DNA copia (cdna) a partir de RNA utilizando una transcriptasa reversa y posteriormente el producto de reacción obtenido se utiliza en una segunda etapa para sintetizar múltiples copias del cdna utilizando la enzima DNA polimerasa bajo una serie de ciclos de temperatura (n) en los que se generan 2 n copias del DNA molde. MOCK: Control negativo del proceso de extracción. CINS (Control positivo para virus influenza estacional AH1, AH3): Control positivo de amplificación utilizado para verificar que las condiciones de reacción se mantienen inalteradas. CINS SW (Control positivo para virus influenza pandémico AH1N1): Control positivo de amplificación utilizado para verificar que las condiciones de reacción se mantienen inalteradas. 1

2 NTC (Not Templete Control): Control negativo de reacción con el cual se debe monitorear la ausencia de contaminantes en los reactivos utilizados en la PCR. 5. CONDICIONES GENERALES El panel de la evaluación externa del desempeño, contiene muestras con material biológico, clasificados como especímenes potencialmente infecciosos lo que indica que deben manejarse con todas las medidas de bioseguridad universales. Evite la generación de aerosoles cuando abra los viales. Conservar las muestras a una temperatura de -70ºC, de esta manera podrán ser estables hasta su procesamiento. 6. MATERIALES Y REACTIVOS No aplica 7. EQUIPOS No aplica 8. CONTENIDO 8.1 Este panel de evaluación externa del desempeño, contiene 10 viales con muestras biológicas liofilizadas provenientes de cultivos celulares originales. Cada uno de estos viales se encuentra estrictamente marcado con un número consecutivo dado por el del. En caso de no coincidir los números de los viales con el documento enviado, favor notificar inmediatamente. A continuación se muestra un ejemplo: Identificación Cantidad de los viales

3 8.2 Reconstitución del RNA seco. Centrifuge los viales que contienen el RNA seco por unos segundos antes de abrirlos. Reconstituya todo el contenido de cada vial en 300 ul de agua libre de RNAsas. Mezcle suavemente, centrifuge brevemente y deje 5 minutos el vial en 4ºC para completar la disolución del RNA. Luego de esto conserve congelado si no va a ser utilizado inmediatamente. 8.3 Instrucciones para diligenciar los documentos de la evaluación externa del desempeño. (Anexos) Estos documentos deben ser devueltos al -INS en el tiempo estipulado, debidamente marcados como se indica a continuación Instrucciones para diligenciar el anexo Al inicio de este anexo, usted encontrará los datos de la institución que remite el panel de evaluación externa del desempeño (), enseguida encontrara una libre para que se diligencie los datos de su institución (nombre, dirección, departamento y ) En la segunda parte, diligencie una serie de preguntas acerca del envío (quien recibe el envió, fecha de recepción, etc), y debe firmarlo el responsable del programa o coordinador el laboratorio y enviarlo inmediatamente de recibido el panel Indicaciones con relación al anexo 2. En este anexo usted encontrara los datos del para comunicarse en caso de alguna inconsistencia o inquietudes acerca del programa Instrucciones para diligenciar el anexo 3. Los siguientes ítems se encuentran relacionados en el documento a diligenciar. (1) Virus a identificar (2) Referencia del Método de extracción utilizado (3) Referencia del protocolo utilizado (4) Referencia de la enzima (5) Referencia de primer y sonda (6) Resultado del ensayo Marque solamente un ítem de acuerdo a la técnica empleada en su laboratorio (virus a identificar, método de extracción, protocolo utilizado, etc) y según las referencias indicadas en el apéndice Si usted fabrica los primers, sondas y enzima marque el cuadro diseño propio. Si los primers, sondas y enzimas son de otra procedencia (comerciales) indique la referencia según el apéndice Instrucciones para diligenciar el Anexo 3 Marque el recuadro según el resultado obtenido para cada muestra por cada ensayo realizado. Pos para un resultado positivo y Neg para resultado negativo Si el ensayo se realiza con PCR tiempo real, por favor indique el Ct (ciclo threshold) o valor de referencia. 3

4 Por favor vea el ejemplo de reporte de este anexo en el documento de excel Instrucciones para diligenciar el Anexo 4. Teniendo en cuenta los resultados y el diligenciamiento del anexo 3, marque en el recuadro la interpretación dada por usted para cada muestra identificada. 9. DOCUMENTOS DE REFERENCIA WHO External Quality Assessment Programme for the Deteccion of Influenza Virus Type A by PCR. 12. ANEXOS 4

5 APENDICE 1 REFERENCIAS DE PROTOCOLOS, ENZIMAS, PRIMERS Y SONDAS REFERENCIAS DEL PROTOCOLO CODIGO A01 A02 PROTOCOLO PUBLICADO Protocolo CDC real-time PCR Protocolo WHO, convencional PCR REFERENCIAS LA ENZIMA PCR CONVENCIONAL CODIGO FABRICANTE KIT/ENZIMA A05 Qiagen Qiagen OneStep RT-PCR Kit A06 Roche Titan One Tube RT-PCR Kit A07 Roche Titan One Tube RT-PCR system A08 Roche Transcriptor One-Step RT-PCR Kit 5

6 REFERENCIAS DE ENZIMA PCR tiempo real CODIGO FABRICANTE KIT/ENZIMA A9 Applied Biosystem Ag Path-ID One-Step RT-PCR Kit A10 Applied Biosystem SYBR Green RT-PCR Reagents A11 Applied Biosystem TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents A12 Applied Biosystem TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents A13 Invitrogen SuperScriptIII Platinum One-Step qrt- PCR Kit A14 Invitrogen SuperScriptIII Platinum SYBR Green One- Step qrt-pcr Kit A15 Roche LigthCycler RNA Master HybProbe A16 Roche LigthCycler RNA Master SYBR Green I REFERENCIAS PRIMERS/SONDAS CODIGO FABRICANTE KIT PRIMER/SONDA A17 Biosearch Biosearch A18 Shanghai ZJ Bio-Tech Co. Ltd. Influenza virus A 1 Real Time RT-PCR Kit A19 Diseño propio

7 ANEXO 1 DE: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD GRUPO DE VIROLOGíA LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS AV CALLE 26 # CAN BOGOTÁ FAX: EXT jbarbosa@ins.gov.co,jmendez@ins.gov,grey@ins.gov.co PARA: LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA ASUNTO: Evaluación Externa del Desempeño Programa para la detección del Virus de la Influenza tipo A por PCR en tiempo real, Panel 2 (2011) Tan pronto como reciba el panel, por favor diligencie esta hoja y envíela al, Grupo de Virología de la Red Nacional de Laboratorios. Fax ext.: o escanear y enviar a los correos electrónicos arriba mencionados. 1. Persona que recibe el envió: 2. Fecha de recepción del envió: 3. Llegaron los viales en buen estado? Si No 4. Número de viales recibidos: 5. Recibió alguna notificación antes de recibir este envió? Si No Observaciones: Firma coordinador: Fecha: / / (dd/mm/aaaa) 7

8 ANEXO 2 Este panel contiene en 10 muestras biológicas liofilizadas con sospecha del virus de Influenza A. Para más información acerca del control de calidad externo, por favor escriba a los siguientes correos: jbarbosa@ins.gov.co, jmendez@ins.gov.co, grey@ins.gov.co Por favor diligencie y envié estos documentos según el tiempo acordado (15 días hábiles después de recibir el panel). El reporte puede enviarse vía correo, fax o a la siguiente dirección: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD GRUPO DE VIROLOGÍA LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS AV CALLE 26 # CAN BOGOTÁ FAX: EXT jbarbosa@ins.gov.co, jmendez@ins.gov.co, grey@ins.gov.co 8

9 ANEXO 3 Formato para el registro de resultados de acuerdo a la técnica de PCR en tiempo real para detección del virus de la Influenza 1. Virus a Identificar Influenza A Influenza A / estacional 2. Referencia del método de Manual Manual extracción realizado Automático Automático A (H1N1)pdm09 Manual Automático 3. Referencia del protocolo utilizado ref 1 4. Referencia de la enzima utilizada ref 1 5. Referencia de los primers / sondas empleados ref 1 6. Resultados del ensayo Ct pos Neg Ct Pos Neg Ct Pos Neg Ref 1. Ver Apéndice 1 páginas 4 y 5 Condiciones de detección: Marca y serie del termociclador: Base line o threshold: Fecha de realización del ensayo: 9

10 ANEXO 3 Ejemplo: Formato para el registro de resultados de acuerdo a la técnica de PCR en tiempo real para detección del virus de la Influenza 1. Virus a Identificar Influenza A Influenza A / estacional 2. Referencia del método de Manual Manual extracción realizado x Automático Automático A (H1N1)pdm09 Manual Automático 3. Referencia del protocolo utilizado ref 1 A02 A01 A02 4. Referencia de la enzima utilizada ref 1 A03 A12 A04 5. Referencia de los primers / sondas empleados ref 1 A18 A_19 A19 6. Resultados del ensayo Ct pos Neg Ct Pos Neg Ct Pos Neg X X x X x X X X X x X X X 25,5 x X X X x X X X X X X x 20,1 x X X x x Ref 1. Ver Apéndice 1 páginas 4 y 5 Condiciones de detección: Marca y serie del termociclador: ligth cicle Base line o threshold: 500URF Fecha de realización del ensayo: 2 de octubre 10

11 Anexo 4 Formato de interpretación de Resultados MUESTRA A ANALIZAR INTERPRETACIÓN (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 MUESTRA A ANALIZAR INTERPRETACIÓN (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 11

12 Anexo 4 Ejemplo: Formato de interpretación de Resultados MUESTRA A ANALIZAR INTERPRETACIÓN x (H1N1)pdm09 /H3 x (H1N1)pdm09 /H3 x (H1N1)pdm09 /H3 x (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 x /H3 MUESTRA A ANALIZAR INTERPRETACIÓN x (H1N1)pdm09 /H3 x (H1N1)pdm09 /H3 x (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 /H3 (H1N1)pdm09 x /H3 12