Intercambio genético en procariotas

Transcripción

1 Intercambio genético en procariotas Recombinación genética: transformación, transducción, conjugación. Plásmidos: tipos, episoma. Transposones y secuencias de inserción Lic en Biología Molecular-2015 Objetivos Diferenciar entre transferencia génica horizontal y vertical Comparar los mecanismos de recombinación genética en bacterias Entender de que manera a través de la recombinación genética se cumple la selección natural Describir funciones de plásmidos, SI y transposones

2 Flujo de la información genética en células procariotas Tomado de : Tortora, G,J.,Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. El genoma procariota evoluciona por : Mutación Rearreglos internos del ADN Adquisición de ADN de otras células por transferencia horizontal (recombinación)

3 Intercambio genético en procariotas Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición Destinos del DNA introducido en la célula receptora: degradado por enzimas de restricción autorreplicarse (solo si posee su propio origen de replicación: plásmido) recombinarse con el cromosoma de la célula receptora u hospedadora

4 Recombinación Intercambio físico de DNA entre elementos genéticos. Implica ruptura física y posterior unión de hebras de ADN de forma tal que intercambian el contenido de ADN resultando en dos nuevas hebras. Se da en sitios específicos de las moléculas de ADN involucradas: secuencias homologas apareamiento Sólo ocurre en zonas con alta homología Permite reparar cromosomas dañados durante la replicación (mantenimiento de información) Recombinación homóloga: entre secuencias homólogas de dos fuentes diferentes Mecanismo: - Helicasa y endonucleasa (Rec BCD) - Proteína de unión a cadena sencilla (SSB) - Rec A (invasión de cadena, región monocatenaria, forma un complejo) - Heterodúplex cada cadena procede de un ADN diferente - Uniones de Holliday - Resolvasa (RecG y RuvC) La recombinación genética en procariotas sólo se produce luego de la transferencia de fragmentos de DNA homólogos desde un cromosoma donador a una célula receptora, mediante transformación, transducción o conjugación Tomado de Brock.. Microbiología a de los microorganismos. 12 edición

5 Detección de la Recombinación Células fenotípicamente diferentes a sus progenitores Células receptoras que carezcan de alguna características seleccionable (auxótrofas) que los recombinantes ganarán La tasa de retromutación para la característica seleccionada sea baja porque los revertientes también formaran colonias Dobles mutantes: cepas con dos mutaciones diferentes, es poco probable que se produzcan dos retromutaciones en una misma célula. Mutantes de desplazamiento del marco de lectura (reversión baja)

6 Intercambio genético Unidireccional: de donante a receptor Puede ser entre especies distintas Mecanismos: 1. Transformación 2. Transducción 3. Conjugación Transformación bacteriana proceso de transferencia genética por el cual fragmentos de DNA son incorporados en una célula receptora y se lleva a cabo un cambio genético

7 Competencia en la transformación Célula competente: célula capaz de aceptar DNA y transformarse Determinadas cepas o especies pueden transformar - Proteínas especificas de competencia: proteína de unión al DNA asociada a la membrana, una autolisina de la pared y varias nucleasas. - Bacillus subtilis: percepción del quórum: un sistema regulador que depende de la densidad celular. Secretan un péptido que en altas concentraciones induce la competencia - Algunos procariotas son competentes de forma natural y fácilmente transformables: Bacillus, Streptococcus. Obtención de células competentes en E.coli: tratadas con iones calcio y luego enfriadas Electroporación: usa breves pulsos eléctricos para introducir DNA electroporador Mecanismo de la transformación en procariotas Proteína de unión de DNA Autolisina Nucleasa Proteína especifica de competencia: protección Rec A Integración de DNA Células competentes fijan hasta 100 veces mas DNA. Fragmentos transformantes son pequeños (S. pneumoniae une sólo 10 moléculas de ADN de kpb) Alta concentración de ADN satura el sistema competencia Solo 1 de cada 100 ó 300 fragmentos de DNA son captados. Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición

8 Experimento de Griffith: demostración de la transformación genética Cepas S Cepas R Las bacterias vivas no capsuladas fueron transformadas por las bacterias muertas encapsuladas que adquieren la capacidad de formar cápsula por lo tanto causar enfermedad DNA Transfección Es el proceso por el que las bacterias pueden transformarse con DNA obtenido de un bacteriófago DNA Bacteriófago lítico Transfección Virus determinar Ensayo de calvas Util para el estudio de los mecanismos de transformación y recombinación: pequeño tamaño de los fagos, permite el aislamiento de una población homogénea de moléculas de DNA. Transformación convencional: fragmentos de ADN al azar Se puede transformar utilizando DNA plasmídico????? Las bacterias se transforman muy poco ya que el plásmido debe mantenerse de doble cadena y circular para poder replicarse.

9 Transducción Transferencia de genes bacterianos a través de un bacteriófago. El bacteriófago transductor no es infeccioso Es frecuente en Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus Bacteriófago Bacteriófagos: Ciclo lítico o lisogénico Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición

10 Transducción: un virus bacteriano transfiere el DNA de una célula bacteriana a otra Transducción generalizada: Cualquier fragmento de DNA del hospedador es empaquetado en el interior del virión maduro en lugar del genoma vírico. Transducción especializada: El DNA de una región especifica del genoma del hospedador se integra en el genoma del virus. Sólo en virus atemperados. Transducción generalizada: pueden formarse partículas del virus con DNA del hospedador Relación fago /bacteria baja Frecuencia Para 1 marcador 1/10 6 Partículas defectivas Tomado de Brock.. Microbiología a de los microorganismos. 10 edición

11 Mecanismo de transducción generalizada en P1 Transducción generalizada: -Cualquier segmento del donador -Infección lítica - Eficiencia de la transducción; baja Transducción especializada -Partículas transductoras: selectivo grupo restringido y especifico de genes del hospedador. -Eficiencia de la transducción: alta -Ej: transducción de genes de galactosa en E. coli conteniendo un fago lambda como profago Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 10 edición

12 Transducción especializada fago λ (atemperado) Para que un virión λ sea viable hay un límite de la cantidad de DNA fágico que puede sustituir con DNA del hospedador El virión debe retener DNA para codificar cubierta proteica, proteínas para lisis, lisogenia 1- Inmunidad: la célula lisogénica es inmune a la reinfección por otro fago del mismo tipo Lisogenia Valor selectivo Supervivencia en la naturaleza 2- Conversión fágica: es la alteración fenotípica de una célula hospedadora que puede exhibir nuevas propiedades o cambios genéticos. Ej: -Salmonella anatum: cambio en la estructura de un polisacárido de la pared celular por lisogenia del bacteriofagoε 15 -Corynebacterium diphteriae: sólo las cepas lisogénicas son productoras de toxina 3-Transducción especializada Genes selectivos

13 Plásmidos elementos genéticos extracromosomales Características generales: DNA bicatenario, superenrollado y circular Se replican independientemente No tienen forma extracelular Portan genes no esenciales Menos del 5% del tamaño del DNA cromosómico Tamaño: 1 a 100 kpb Nº de copias: 1-3; 100 Replicación: Gram negativos: Igual al cromosoma: ori R, bidireccional, theta Gram positivos: mecanismo del circulo rodante. Intermediario monocatenario. Cebador proteico 5. Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición Incompatibilidad: Varios plásmidos en una bacteria, todos genéticamente distintos Los del mismo grupo se excluyen (Grupo Inc) para replicarse en la misma célula, (genes del plásmido que lo controlan) Coexisten con los de otros grupos Curación: Eliminación de plásmidos de la célula bacteriana. Tratamiento con productos químicos (acridina) Efecto de la dilución: inhibición de la replicación del plásmido Plásmidos de resistencia se pierden si no hay antibióticos Episomas Plásmidos que se integran al cromosoma bacteriano y la replicación bajo control del cromosoma bacteriano

14 Tipos de plásmidos Plásmidos que confieren propiedades metabólicas especiales, degradar contaminantes tóxicos Contienen genes para: control de replicación incompatibilidad, transferencia de inserción (células Hfr) Plásmidos que codifican toxinas y otras características de virulencia Ej: factor antigénico de colonización, hemolisina, enterotoxina de E. coli enteropatógenas Plásmidos que producen bacteriocinas: Ej: Colicinas de E. coli: forma canales en la m. celular, incapacidad de generar energía. Nucleasas de E.coli: E2 y E3 Nisina A conservante en Industria alimentaria (Gram+) Puede ser transferido entre cepas de Escherichia, Klebsiella, Proteus Salmonella, Shigella

15 Plásmidos conjugativos Plásmido F - DNA circular - Genes que regulan su replicación - Elementos transponibles: secuencias de inserción - Región tra: transferencia, apareamiento y síntesis del pelo sexual. Características esenciales El plásmido conjugativo utiliza el mecanismo de conjugación para: 1-transferir copias de si mismos 2-transferir el cromosoma de la célula donadora, cuando se integra como un episoma. Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12 edición Conjugación Una célula donadora que contiene el plásmido conjugativo (F + ) transfiere DNA a una célula aceptora que no lo contiene (F - ). Implica el contacto entre células bacterianas (apareamiento). Codificado por un plásmido.

16 Pelos sexuales Presentes solo en células donadoras Forma un contacto especifico con un receptor en la célula receptora (apareamiento especifico) Se retrae, desensamblando sus unidades Atracción entre las dos células Las células siguen en contacto por proteínas de unión El DNA se transfiere de la célula donadora a la receptora a través de esa conexión conjugativa Tomado de : Tortora, G,J.,Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Transferencia de DNA plasmídico por conjugación Eficiente, rápida 100 kpben 5 min Síntesis de ADN por replicación de círculo rodante no por semiconservativa normal Tomado de Brock.. Microbiología a de los microorganismos. 12 edición

17 Conjugación: transferencia de genes cromosómicos Formación de cepas Hfr y movilización cromosómica por conjugación El plásmido F es un episoma que se integra en el cromosoma de E. coli Puede movilizar al cromosoma bacteriano durante la conjugación Las células que poseen un plásmido F: F+ Las células que poseen un plásmido F integrado en el cromosoma: Hfr Conjugación: Hfr + F - Hfr altas tasas de recombinación genética entre genes cromosómicos del donador y del aceptor Replicación por mecanismo de circulo rodante del DNA plasmídico y del cromosoma Transferencia de genes cromosómicos Integración del plásmido F en el cromosoma bacteriano Secuencias de inserción (IS): elementos móviles presentes en el cromosoma de E. coli y el plásmido F que proporcionan regiones de homología de secuencia que conducen a su integración. Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 10 edición

18 Transferencia de DNA cromosómico por conjugación Las cepas Hfr no convierten las F- en F+ o Hfr porque raramente se transfiere el plásmido completo. El cruce Hfr x F- genera el Hfr original (retiene una copia del plásmido integrado) y un F- con un genotipo nuevo. Tomado de : Tortora, G,J.,Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Detección de la conjugación En la conjugación a diferencia de la transformación y transducción las células donadoras como receptoras son viables Se usan auxótrofos Tomado de Brock.. Microbiología a de los microorganismos. 10 edición

19 Acoplamiento interrumpido de genes La transferencia de cromosoma desde Hfr a F- es alrededor de 100 minutos para transferir el cromosoma entero. El proceso de conjugación puede ser interrumpido usando una mezcladora A diferentes tiempos se puede determinar la proporción de células F- que han recibido un marcador dado Esta técnica puede ser usada para mapear el cromosoma circular de E. coli (orden) Genes cerca del origen de transferencia Entran primero en la célula receptora y están presentes en mayor % de recombinantes Resumen de la conjugación Células F+: contienen el factor F en el citoplasma y pueden transferir F con alta eficiencia a células F- durante la conjugación. Células Hfr: tienen el F integrado dentro del cromosoma bacteriano y no en el citoplasma.. Celulas F : plásmidos F previamente integrados en el cromosoma que al escindirse capturan algunos genes cromosómicos identificables. Permite la conjugación de un grupo restringido de genes a alta frecuencia. Similitud a transducción especializada. Células F- : no contienen el plásmido F y no pueden transferir DNA por conjugación. Ellos son recipientes de DNA transferido desde F+, F ó Hfr por conjugación.

20 DNA móvil: elementos genéticos transponibles Segmentos de DNA capaces de mudarse de una localización a otra Producen: inserciones, delecciones, cambio de expresión Siempre insertos en otra molécula de DNA Movimiento al azar No poseen su propio orir Se replican como parte de otra molécula de DNA: cromosoma, plásmido o virus Proceso Transposición mediante recombinación especifica (transposasa) Secuencias invertidas cortas Tipos de Elementos Transponibles Secuencias de Inserción (IS): Elementos que portan sólo genes de transposición. Segmentos cortos, sencillos. Transposasa y repeticiones invertidas en los extremos. Se encuentran en el cromosoma o plásmidos. ABCDEFG Transposasa GFEDCBA Transposones (Tn): Elementos que portan otros genes además de los de transposición. Mas grandes. Transposasa y repeticiones invertidas en los extremos. Incluyen genes de resistencia a antibióticos

21 Bacteriófago Mu : Genoma vírico completo contenido dentro de un transposón. Se inserta aleatoriamente en el genoma del hospedador. Tras la inducción Mu se replica transponiéndose. Es un transposón con capacidad de encapsidar su ADN en una estructura viral. Los elementos transponibles se integran por recombinación sitio específica La transposasa realiza cortes escalonados en el ADN diana generando extremos de simple hebra y cataliza la integración. La inserción de un elemento transponible genera duplicación de la secuencia diana El ADN de simple hebra es reparado por la maquinaria celular

22 Mecanismo de transposición: conservativo o replicativo La transposasa inserta el transposón (lila) en el sitio diana (azul) del receptor. La secuencia diana se duplica. En la conservativa, el DNA donador se queda con el corte en la doble cadena en la ubicación previa del transposón. En la replicativa, el DNA donador y el receptor contienen una copia del transposón Mecanismo de transposición: replicativo

23 Mutagénesis por transposones Cuando un transposón se inserta en el interior de un gen, ese gen sufre una mutación Las mutaciones auxótrofas debida a inserción de transposones (R a ATM) son útiles en genética bacteriana Permite determinar si un nutriente es indispensable Conclusiones La recombinación genética contribuye a la diversidad genética de la población Evolución La transferencia génica vertical: los genes pasan de un microorganismo a su descendencia Transferencia génica horizontal: los genes pasan a otros microorganismos de la misma generación (no descendiente) Mecanismos de transferencia de información genética Transformación Transducción Conjugación

24 bacteriana Muchas gracias