Objetivos del tema El alumno...

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1 Objetivos del tema El alumno... IV. GENÉTICA BACTERIANA 1. Tipos de mutaciones en bacterias 2. Bacteriófagos y virus eucariontes Comprenderá los mecanismos de la genética de virus, bacterias y elementos genéticos móviles. Revisará los mecanismos por los que se producen las mutaciones en las bacterias y sus virus, conocerá su utilidad para el mapeo génico en procariontes a partir de los mecanismos de transferencia horizontal de material genético y comprenderá la importancia de los elementos genéticos móviles en la evolución de los genomas Conocerá la nomenclatura para referirse a los fenotipos y genotipos de bacterias mutantes. X Conocimiento Comprensión Aplicación 1.2. Entenderá los métodos para la generación y selección de X bacterias mutantes Describirá la composición química de los virus. X 2.2. Analizará los ciclos lítico y lisogénico de los bacteriófagos. X 2.3. Conocerá las características y ciclos de infección de algunos virus de eucariontes mediante los ejemplos del virus VIH y el de influenza. 3. Plásmidos 3.1. Definirá la estructura, propiedades y funciones del plásmido F bacteriano. 4. Mecanismos de transferencia horizontal del material genético 5. Elementos genéticos móviles 4.1. Conocerá los procesos de transformación, transducción y conjugación Comparará los mecanismos de transferencia de información genética en bacterias Aplicará los procesos de transferencia horizontal de material genético en la elaboración de mapas genéticos de virus y bacterias basados en la recombinación sitio específico Conocerá la estructura y función de las secuencias de inserción y transposones Discutirá la función de los elementos genéticos móviles en la producción de cambios en los genomas. X X X X X X X

2 GENÉTICA BACTERIANA

3 Qué es un mutante? Un organismo que desciende directamente de un miembro normal (silvestre) pero que es diferente Qué es una mutación? Un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos en el DNA Una mutación no necesariamente es deletérea En algunos casos puede ser ventajosa En otros casos puede no producir ningún cambio observable

4 Un cambio que sea letal no puede ser considerado una mutación pues ésta debe ser heredable Para la genética y la biología molecular, las mutantes son útiles para estudiar cómo se regulan los genes, qué codifican o cuál es la función de su producto génico.

5 Las mutaciones son preadaptativas, es decir no se generan en respuesta a la presencia del agente selectivo. se generan espontáneamente y el agente selectivo solo las selecciona. Lederberg y Lederberg, 1952

6 Tipos de mutaciones Cambios en una sola base Transición: cambia pur x pur o pyr x pyr Transversión: cambia pur x pyr Frameshift mutations (cambia la fase de lectura del mensaje) Deleción de una sola base Inserción de una sola base Una secuencia de pares de bases Deleción Inserción Una larga región de DNA Duplicación Inversión

7 Frameshift (cambio del marco de lectura) Al insertarse o perderse un nucleótido ocurre un cambio en el marco de lectura del mensaje.

8 Cómo se genera una mutante? De manera natural, por errores en la replicación Por exposición a agentes mutagénicos como: Agentes físicos: luz UV, rayos X, rayos gamma Agentes químicos: anaranjado de acridina, otros... Y en el lab...? Existen métodos que permiten generar mutaciones que luego se pueden mapear para saber cuál gen fue el que se alteró. Uno de estos métodos es la mutagénesis por transposición.

9 Tipos de mutantes bacterianas PROTOTROFÍA/AUXOTROFÍA Las cepas silvestres son protótrofas (crecen en medio mínimo). Las cepas auxótrofas son mutantes incapaces de sintetizar algún metabolito esencial, por lo que éste debe ser añadido al medio (bio -, arg -, met -, ad - ) UTILIZACIÓN DE DIVERSAS FUENTES DE ENERGÍA Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos: galactosa (gal - /gal + ); lactosa (lac - /lac + ) RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Capacidad de crecer en presencia de inhibidores, como antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc. str R /str S ; amp R /amp S Otras características como morfología de las colonias y pruebas bioquímicas también se emplean.

10 Medio mínimo: medio sintético básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales

11 Cultivos de bacterias Suspensión celular bacteriana Suspensión plaqueada en caja con agar Incubación 1 2 días Caja Petri con agar Células individuales invisibles a simple vista Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo) Aislamiento de mutantes

12 Una de las bacterias más estudiadas Escherichia coli Descubridor: Theodore Escherich Qué ventajas presenta para uso de laboratorio?

13 Vías de intercambio de genes entre bacterias Transferencia horizontal Transformación Transferencia parcial del genoma por consumo de DNA Conjugación Plásmidos Conjugación Genoma Transferencia de plásmidos durante la conjugación Transferencia parcial del genoma durante la conjugación Transducción Transferencia como parte del genoma viral

14 En la transformación, DNA exógeno es introducido a la célula e incorporado al DNA cromosomal por recombinación. Una de las dos cadenas es hidrolizada y el DNA de cadena sencilla que queda es protegido por proteínas de unión a DNA de cadena sencilla (SSBP) y está disponible para recombinarse con el DNA cromosomal. No todas las bacterias se transforman de manera natural

15 La transformación puede ser inducida en el laboratorio por métodos químicos E. coli no se transforma de manera normal debe hacerse competente Se emplean plásmidos como vectores para introducir los genes deseados

16 Plásmidos Moléculas de DNA circulares extracromosomales que tienen su propio origen de replicación y se encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes.

17 Características de los plásmidos Usan la misma maquinaria de replicación del DNA cromosomal y contienen un origen de replicación. Se clasifican en: de bajo número de copias (1-10 copias por célula) de alto número de copias ( copias por célula) Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido. Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados, excluyéndolos así de la célula.

18 Los plásmidos codifican diversas funciones que le permiten, a la bacteria que los contiene, sobrevivir en distintos habitats Funciones de resistencia Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, -lactamas) Metales pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi) Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos) Funciones metabólicas Producción de bacteriocinas Metabolismo de carbohidratos Metabolismo de compuestos carbonados Factores que intervienen en la interacción con el hospedero Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli) - endotoxina (Bacillus thuringiensis) Neurotoxina (Clostridium tetani) Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)

19 Descubrimiento de la conjugación Lederberg y Tatum, 1947

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21 Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra este intercambio Medio mínimo Experimento de Lederberg y Tatum

22 Conjugación en Escherichia coli F + (Factor de fertilidad) Pili F - F + Plásmido F *Plásmido F codifica alrededor de 100 genes William Hayes, 1953

23 Participan dos tipos de células: CONJUGACIÓN donadoras/machos que tienen el plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) (F + ) receptoras/hembras que no lo tienen el plásmido F (F - ) El plásmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican proteínas involucradas en la replicación del DNA. Otros genes codifican proteínas tubulares que forman el pilus.

24 Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto físico entre bacterias (F + y F - )

25 Conjugación. Apareamiento entre bacterias (F + y F - ) La célula F + inicia la conjugación al sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la célula F - El pilus se retrae y acerca a las dos células.

26 La cadena de DNA recién transferida también se replica. Las dos células contienen un plásmido F íntegro, por lo que ambas son F + Una de las cadenas del DNA F es cortada y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra célula, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se quedó en la célula F +

27 Qué nos indica el evento de conjugación? Es el plásmido F el responsable de fenotipo silvestre después de la conjugación? NO!!

28 Células Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad que tiene el plásmido F es su capacidad de integrarse al cromosoma bacteriano, incrementando el tamaño de éste. Cuando el plásmido F se integra al cromosoma, la célula ya no es F + sino es Hfr. Episoma. Fragmento de DNA que puede existir como plásmido y que se puede integrar al cromosoma. La célula Hfr mantiene su capacidad de conjugación, por lo que se puede aparear con una célula F -

29 Como se transfirió un fragmento del DNA cromosomal, y si hay homología con el cromosoma de la célula receptora, ocurre recombinación con alta frecuencia (Hfr) Al conjugarse una Hfr se lleva a cabo la transferencia de material genético, empezando por el DNA cromosomal. Generalemente, no se transfiere el cromosoma completo pues las células se separan, por lo que, la secuencia del plásmido F no se transfiere.

30 Una característica importante del apareamiento Hfr / F - es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F.

31 F integrado

32 Integración del plásmido F al cromosoma Regiones homólogas donde el apareamiento entre bases puede ocurrir O O Dirección de la transferencia Tanto el cromosoma bacteriano como F son circulares

33 Después de 2 h algunos exconjugantes se convierten en Hfr F d c b a O

34 La bacteria donadora contribuye con una fracción de material genético a la bacteria receptora El fragmento de DNA donado es llamado exogenota y el genoma receptor el endogenota Una bacteria que contiene ambos DNAs, el exogenota y el endogenota es un merocigoto a + b + Exogenota a b Endogenota

35 Recombinación entre exogenote y endogenote No viable El entrecruzamiento debe ser Doble para que ocurra integración estable! a + a No viable a a + + Viable Recombinantes recíprocos Merocigoto

36 Corolario 1. El cromosoma de E. coli es circular. 2. El plásmido F es circular. 3. La orientación en la que se integra F al cromosoma determina la dirección de la transferencia 4. Un extremo de F integrado es el Origen donde comienza la transferencia y el otro extremo es el término que generalmente NO se transfiere a menos que antes se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.

37 Resumen de la Conjugación bacteriana

38 Una característica importante del apareamiento Hfr / F - es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F. Esta propiedad permite controlar la cantidad de información genética transferida y mapear la posición de los genes transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo de conjugación.

39 Mapeo de genes en E. coli por conjugación El tiempo que se requiere para que los genes entren en la célula receptora está asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano. El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F - receptora. Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán transferencias parciales de los genes. El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.

40 Experimento de Conjugación a tiempos controlados. Cepa Donadora Hfr: thr + ; leu + ; azi s ; ton s ; lac + ; gal + ; str s Cepa receptora (F-): thr - ; leu - ; azi r ; ton r ; lac - ; gal - ; str r 1. Poner en contacto a las dos cepas 2. Interrumpir por agitación la conjugación a distintos tiempos 3. Sembrar en medio con streptomicina (elimina a la cepa donadora) 4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes

41 Resultados del Experimento Tiempo de conjugación (min) % de colonias que sobreviven con los genotipos indicados thr + leu + azi s ton s lac + gal +

42 Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli Punto de inicio Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria F- receptora durante el experimento de conjugación

43 Mapeo por frecuencia de recombinantes Si seleccionamos met como marcador: 100% met + 60% arg + 10% leu + Estos porcentajes indican orden de transferencia pero NO distancia entre genes

44 Observando el orden en que los genes son transferidos en una conjugación podemos saber el orden que tienen en el cromosoma

45 CONJUGACIÓN F En células Hfr, ocurre con baja frecuencia que, F se escinde del cromosoma y forma un plásmido circular nuevamente. Cuando esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma que ahora se encuentran formando parte del plásmido F. Entonces, a éste se le llama plásmido F.

46 CONJUGACIÓN F Los plásmidos F también pueden ser transferidos por conjugación Con esta transferencia se pueden crear células diploides parciales (merocigotos parciales).

47 A los factores F que tienen genes bacterianos se les llama episomas (F )

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49 Genética de bacteriófagos

50 Generalidades de Virus Tamaño nm DNA o RNA, de cadena simple o doble Cubierta de proteínas con o sin lípidos Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola Virus de la influenza (200 nm)

51 Clasificación de fagos de acuerdo a su estructura Icosahédricos sin cola ( X174) Icosahédricos con cola ( ) Filamentosos (M13) Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína

52 El genoma de los fagos RNA simple cadena (MS2, Qß) RNA doble cadena (phi 6) DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) DNA doble cadena (T3, T7, lambda, T5, Mu, T2, T4) Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares, el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago algunas de las bases están parcialmente sustituidas.

53 Fago libre Componentes del Fago Bacteriofago T4 virulento Cabeza Cuello y collar Fago infectando Centro Vaina Placa Basal Fibras

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55 Ciclo Lítico Ciclo de Replicación del Bacteriofago T4 1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe 2+ ) 2. Inyección del material genético viral 3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales 4. Replicación del material genético viral 5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberación de las partículas virales

56 Ciclo lítico

57 Halos o placas de lisis de los fagos

58 Ciclo Lisogénico (Fagos temperados) 1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria. 2. Transcripción de genes necesarios para la integración. 3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración) 4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente. 5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno. 6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos.

59 Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano El cromosoma del bacteriófago lambda ( ) en estado libre es circular. El sitio de integración es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriofago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.

60 Bacteria lisogénica portadora de Profago

61 El DNA del bacteriofago es lineal con extremos cohesivos, lo cual permite que pueda circularizarse

62 Integración de al cromosoma bacteriano

63 Bacteriófago lambda ( ) (fago temperado) Ciclo lisogénico Ciclo lítico

64 TRANSDUCCIÓN Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriófago

65 Transducción Transferencia de material genético bacteriano por los virus de bacteria (fagos) phe trp tyr met his WT Requiere de contacto para que el fago pueda infectar

66 Profago Cromosoma bacteriano Inducción del ciclo lítico La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal Replicación del fago Lisis celular y liberación del fago La célula receptora adquiere nuevos genes Integración del DNA del fago al cromosoma El fago infecta a la célula receptora

67 Transducción Transducción generalizada: es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser transferido a la célula receptora. Transducción especializada: La transducción especializada es la transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor.

68 Transducción generalizada Los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el DNA de la célula huésped en pequeñas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la partícula fágica mediante un mecanismo llamado head full o llenado de las cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas del DNA de la bacteria huésped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto cualquier gene de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferirá tanto DNA como pueda caber en una sola cápside. Cuando la célula receptora se infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el DNA de la donadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora puede ocurrir el evento de la recombinación generalizada, en el cual se substituye el DNA de la célula donadora por el de la receptora. Fagos llevando genes de la célula donadora

69 Transducción especializada Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transducción especializada está mediada por fagos lisogénicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir dependerán del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma.

70 Mapeo de genes empleando transducción Células donadoras: arg + ; met +, str s Infección con el fago P1. Ciclo lisogénico. Integración. Ciclo lítico y cosecha de fagos. Mezclar los fagos con la bacteria receptora: arg - ; met - ; str r

71 Selección fenotípica de las bacterias receptoras. Ciclo lisogénico del bacteriofago

72 Transposones (Elementos genéticos móviles) La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima). Fueron descubiertos originalmente en maíz por Barbara Mc Clintock y su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos.

73 Descubrimiento de los transposones eucariontes Elementos de Control Barbara Mc Clintock, 1951

74 Tipos de transposones Secuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contiene una secuencia central con el gen de la transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso no nesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del DNA aparece una repetición directa de la secuencia diana (5-12 pb). Transposón Compuesto (Tn): contiene un elemento de inserción (IS) en cada extremo, en orden directo o inverso y una región central que además suele contener información de otro tipo. Por ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF) poseen información para resistencia a antibióticos (cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.).

75 Elemento Características de algunos elementos IS Longitud Repetición terminal invertida Repetición directa de la diana Selección de la diana IS1 786 pb 23 pb 9 pb Regional IS pb 41 pb 5 pb Zona caliente IS pb 18 pb pb AAAX 20...XTTT IS pb 16 pb 4 pb Zona caliente Características de algunos Transposones compuestos (Tn) Elemento Longitud Marcador genético (resistencia) MÓDULOS TERMINALES IS Orientación Relación entre ambos Tn pb Tetraciclina IS 10 Invertida Divergencia 2.5% Tn pb Kanamicina IS 5 Invertida Difieren en 1 pb Tn pb Kanamicina IS 903 Invertida Idénticos Tn pb Cloranfenicol IS 9 Directa Idénticos (?)

76 Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar integrados en una molécula de DNA, que contenga un origen de replicación, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un plásmido, nunca se encuentran libres. Cromosoma de E. coli Algunos elementos pueden estar en varias copias

77 Transposones en procariontes Secuencias de inserción (IS) Frecuencia global de transposición: Frecuencia individual de transposición: Reversión de la transposición:

78 Transposones El tamaño de los transposones varía entre 10 3 a 10 4 pb dependiendo del tipo de transposón. La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma. La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.

79 Dos formas de transposición Replicativa Conservativa

80 Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón. Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas. Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. Kan S Kan R Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp. Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec. Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet.

81 Mecanismo de transposición (recombinación ilegítima) Repetidos directos (5-9 pb)

82 Transposición conservativa Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.

83 Transposición replicativa Transposasa Resolvasa

84 Transposones de eucariontes Retrotransposones Transposones de DNA

85 Los retrovirus se integran al DNA provirus

86 Los transposones pueden causar reordenamientos y cambios en los genomas

87 Transposones Duplicación de DNA Virus Transferencia de DNA Evolución de genomas

88 Uso de los transposones para generar una colección de mutantes (mutagnénesis por transposición) 1. Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: Pam int - ::Tn5 2. Cuando este fago infecta células Kan S, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva Kan R es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas. 3. Si se infectan 2 x 10 9 células, se obtendrán aprox. 2 x 10 4 colonias Kan R. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes.

89 Transferencia horizontal de genes entre distintas especies e incluso géneros de bacterias

90 Mecanismos de resistencia a antibióticos y su transmisión 1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma. 2. Modificación e inactivación del antibiótico. -lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa. 3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las -lactamas. 4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas.

91 1. Cuatro cepas Hfr de E. coli procedentes de la misma cepa F + transfieren los siguientes marcadores en el orden: Cepa 1: M Z X W C Cepa 2: L A N C W Cepa 3: A L B R U Cepa 4: Z M U R B Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F + original? 2. Se realiza un cruzamiento entre una cepa Hfr arg + bio + leu + y una cepa F arg bio leu. Experimentos de conjugación interrumpida demuestran que arg + entra en el receptor en último lugar, de modo que se seleccionan recombinantes arg+ para determinar la presencia de bio + y leu + encontrando los siguientes números: arg + bio + leu arg + bio + leu 8 arg + bio leu + 0 arg + bio leu 48 Cuál es el orden de estos marcadores? Cuáles son las distancias en unidades de mapa?