VIRUS y BACTERIÓFAGOS

Transcripción

1 VIRUS y BACTERIÓFAGOS Propiedades generales Referencia: Brock.Biología de los microorganismos. 12 ed Microbiología Lic. en Biología Molecular UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS ARGENTINA

2 Propiedades generales de los virus: Virus: agente infeccioso que no puede replicarse fuera de una célula hospedadora. No es una célula. Virión: forma extracelular de un virus Es la estructura que se propaga de una célula hospedadora a otra Contiene ácido nucleico como genoma, rodeado por una cubierta proteica y en algunos casos, otras capas externas 2012 Pearson Education, Inc.

3 Comparación de tamaños de virus y bacterias M. electrónico M. óptico Fuente: Lim, Microbiology. Ed. McGraw-Hill, Estados Unidos.

4 Simetria (forma) helicoidal icosaédrica

5 Simetría mixta Bacteriófagos

6 Figure 9.11 CLASIFICACION DE BALTIMORE Cómo se replican los virus según su ácido nucleico? dsdna ( ) virus ssdna ( ) virus Class I Class VII Class II dsrna ( ) virus Class III Synthesis of other strand dsdna intermediate Transcription of minus strand ssrna ( ) virus Class IV Used directly as mrna ssrna ( ) virus Class V Transcription of minus strand ssrna ( ) retrovirus Class VI Reverse transcription Transcription of minus strand Transcription of minus strand mrna ( ) mrna ( ) Genome replication: Class I, classical semiconservative Class II, classical semiconservative, discard ( ) strand Class VII, transcription followed by DNA viruses reverse transcription 2012 Pearson Education, Inc. dsdna intermediate Genome replication: Class III, make ssrna ( ) and transcribe from this to give ssrna ( ) partner Class IV, make ssrna ( ) and transcribe from this to give ssrna ( ) genome Class V, make ssrna ( ) and transcribe from this to give ssrna ( ) genome Class VI, make ssrna ( ) genome by transcription of ( ) strand of dsdna RNA viruses

7 ENZIMAS DE LOS VIRIONES Sólo ácido nucleico y cápside? -Lisozima -RNA polimerasas -Transcriptasa reversa -Neuraminidasas -Hemaglutininas

8 CÓMO CULTIVAR VIRUS? -Bacteriófagos Son virus de bacterias Requiere: -Medio de cultivo -Bacteria -Bacteriófagos

9 CÓMO CULTIVAR VIRUS? Virus humanos y animales: -huevos embrionados - cultivos primarios y líneas celulares

10 Cultivos celulares Un cultivo celular se obtiene induciendo el crecimiento de un órgano del animal de experimentación. Se separan las células por instrumentación quirúrgica, disociación de las mismas por tratamiento enzimático para romper las uniones intercelulares. Se coloca en una superficie plana (caja de Petri, o botella de Roux) y se adiciona medio de cultivo líquido. Se forma una monocapa porque las células liberan material glicoproteico que permite su adhesión en el fondo El medio es complejo, tiene aminoácidos, vitaminas suero fetal bovino (SFB), sales, glucosa, buffer, indicador de ph, antibióticos, antifúngicos.

11 Alteraciones inducidas por virus en las células huésped Efecto citopático: -Destrucción de la monocapa -Formación de células multinucleadas (sincitios) -Desarrollo de cuerpos de inclusión -Transformación

12 BACTERIOFAGOS Virus de bacterias Receptores de fagos en Escherichia coli: -LPS (lipopolisacárido) -pili sexual -proteína de captación de hierro -proteína transportadora de maltosa

13 ETAPAS de INFECCIÓN por BACTERIÓFAGOS -Unión o adsorción del virión a la célula hospedadora. -Penetración, entrada o inyección del ácido nucleico en la célula -Ciclo lítico Ciclo lisogénico -Síntesis del ácido nucleico y las proteínas del virus. -Ensamblaje de las cápsides y empaquetamiento de los genomas víricos en ellas. -Liberación de los viriones maduros por lisis celular o por gemación. - Integración en el genoma del hospedador - Replicación de la bacteria y síntesis de nuevas proteínas (ej. toxinas)

14 CICLO LÍTICO Fago virulento CICLO LISOGÉNICO Fago temperado o profago Bacteria lisógena n_quiz_2.html

15 Evolución temporal de la infección por T4

16 -Bacteriófagos: cuantificación MICROSCOPIO ELECTRÓNICO PLACAS de LISIS

17 -No siempre coincide la cuantificación por distintos métodos. Por qué? Microscopio electrónico Ej. : - virus defectivos - cápsides vacías > Recuento de placas de lisis

18 Cómo la bacteria evade la infección por un virus? -Ausencia de receptores en el hospedador -Endonucleasas de restricción, para cortar DNA de fagos -CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) funcionan como sistema inmune en bacterias y archae. Como RNAi, silenciarían la expresión de DNA extraño como plásmidos y fagos. CÓMO SE DEFIENDE UN VIRUS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEL HOSPEDADOR? -Modificando su propio DNA por: - glicosilación - metilación -acetilación -Codificando proteínas que inhiben los sistemas de restricción de la bacteria

19 ENTIDADES SUBVÍRICAS - VIRUS DEFECTIVOS O SATÉLITES -VIRUS AUXILIARES -VIROIDES -PRIONES

20 Viroide Prión (PrnP) (PrPSC) Es una proteína patógena que tiene alterada su estructura terciaria, con un incorrecto plegamiento. Sin ADN ni ARN, sólo aminoácidos.

21 Figure 9.28 Neuronal cell Nucleus Prnp DNA Transcription Translation Normal function PrPc (normal prion) PrPSc-induced misfolding PrPSc (misfolded prion) 2012 Pearson Education, Inc. Abnormal function

22 La enfermedad por priones ocurre por 3 mecanismos posibles: Infecciosa: la forma patogénica de la proteína priónica se transmite entre animales o humanos Esporádica: mal plegamiento al azar de una proteína priónica normal en un individuo sano Por vía hereditaria: una mutación en el gen de la proteína PrP se traduce en una proteína que cambia para convertirse en patógena.

23 VIRUS REACCIONES A LOS AGENTES FISICOS (I) Calor: los afecta. Frío: Son sensibles. Sales: los virus se estabilizan mediante la adición de sales como MgCl2, MgSO4 y Na2SO4. ph: los virus son estables entre ph 5 y 9. Radiación UV, RX y partículas de alta energía: los afecta.

24 VIRUS REACCIONES A LOS AGENTES QUIMICOS (II) Éter: virus envueltos: los afecta. Formol: suprime la infectividad de virus al reaccionar con su ácido nucleico. Se emplea en la producción de vacunas a base de virus inactivados. Antibióticos y otros antibacterianos: no tienen efecto sobre los virus. Amonio cuaternario y compuestos a base de yodo: no los afecta. Hipoclorito de sodio: efectivo en concentraciones mayores que las requeridas para destruir bacterias.

25 RNA ss MS2 ds 6 ssdna 174 fd, M13 dsdna T3, T7 Mu VIRUS 2da. parte : BACTERIÓFAGOS 2012 Pearson Education, Inc. Lambda T2, T4

26 VIRUS MODELOS: -Fago T4 -Fago lambda

27 Bacteriófago T4 -Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli -Es virulento: desencadena ciclos líticos DNA: - bicatenario -codifica algunos de sus propios trna -Tiene repeticiones terminales y presenta permutación circular -Tiene la base 5-hidroximetilcitosina (en lugar de citosina) que se glicosila y permite resistir ataque por ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION del hospedador.

28 Pared de E. coli Adhesión del bacteriófago T4 a la pared de Escherichia coli e inyección de DNA. (Brock. Cap. 9. XIII Ed. 2012).

29 Características del bacteriófago T4: redundancia terminal y permutación circular Redundancia terminal: generación de moléculas de ADN de T4 con secuencias permutadas por una endonucleasa que corta longitudes constantes de ADN sin tener en cuenta la secuencia. Izquierda: copias de T4 se recombinan para formar un concatemero. Medio: flechas rojas, sitios de cortes de la endonucleasa. Derecha: moléculas genoma generado. Cada uno de los genomas T4 formados contiene los genes A a G, pero los terminales son únicos en cada molécula.

30 Redundancia terminal, donde cada cromosoma comienza y acaba con la misma secuencia de nucleótidos Permutación circular, en la que los extremos redundantes no son los mismos para cada cromosoma, sino que son aleatorios.

31 Evolución de la infección por bacteriófago T4

32 BACTERIÓFAGO LAMBDA

33 Bacteriófago LAMBDA -Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli DNA: -Predomina la expresión de un represor de lisis (ci) -Por eso se llama FAGO ATEMPERADO o PROFAGO: se integra al DNA de la bacteria que infecta y produce ciclos lisogénicos. -Las bacterias lisogenizadas presentan nuevas propiedades, por ej. pueden producir toxinas.

34 CARACTERÍSTICAS DEL FAGO LAMBDA -Las bacterias infectadas por fago lambda son inmunes al ataque por partículas similares -Puede revertir a fago virulento: la inactivación del represor de lisis (ci) induce el CICLO LÍTICO debido al aumento de la expresión de la proteína Cro. represor de lisis (ci) vs proteína Cro -El DNA es lineal bicatenario con extremos 5 cohesivos formados por 12 nucleótidos complementarios: sitio cos. Al entrar al hospedador se aparean y el DNA pasa a ser circular. -Se integra al cromosoma de Escherichia coli por el sitio att.

35 GENOMA DE LAMBDA ci > Cro => LISOGENIA CICLO LÍTICO O LISOGÉNICO? Cro > ci => LISIS

36 LISOGENIA Integración de ADN de lambda en el hospedador Bacteria hospedadora expresa nuevas propiedades Ej: toxinas

37 Replicación de lambda por el círculo rodante primers 3 CICLO LÍTICO

38 FAGO LAMBDA: CICLO LISOGÉNICO o LÍTICO? Ciclo lisogénico: -Síntesis activa de ci (represor de ciclo lítico) -Genoma de fago lambda está integrado en el DNA del hospedador -No hay producción de proteínas tardías Ciclo lítico: -Síntesis de grandes cantidades de Cro -Cro reprime proteínas cii y ciii que inducen síntesis de ci -Proteasa FtsH del hospedador degrada cii. Esto afecta a ci.

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40 work/animations/lambda/lambda.html

41 CURIOSIDADES DE OTROS BACTERIÓFAGOS

42 Fago MS2 -SOLAPAMIENTO DE GENES -HOSPEDADOR: E. coli F+ (con plásmido conjugativo), tiene pili sexuales donde el fago se une.

43 Fagos M13, fd, f1 Pared de la bacteria GEMACIÓN -No produce lisis de la bacteria, se libera por GEMACION M13 se usa como vector de clonación en Ingeniería Genética.

44 Fago M13 Región intergénica de M13: -promotor lacp -gen lacz de beta-galactosidasa - un sitio de clonado múltiple M13 bacteria sensible Placas de lisis por M13 sin inserto: azules Placas de lisis por M13 con inserto: incoloras DNA foráneo (inserto) Sustrato: X-gal

45 Bacteriófago Mu (mutador) -Acetilación de residuos de adenina para eludir los sistemas de restricción del hospedador -FAGO ATEMPERADO: Se integra dentro de genes del hospedador e induce MUTACIONES en el genoma del hospedador -Puede revertir a CICLO LÍTICO -Se replica POR TRANSPOSICIÓN Fago Mu se usa en Ingeniería Genética para generar fenotipos bacterianos mutantes.

46 Mu y la región invertible G: determina especificidad de hospedador Especificidad de hospedador según fibras de cola: G+ (lee SU): E. coli K12 G- (lee S U ): otros hospedadores

47 METODOS COMUNES PARA INACTIVAR VIRUS A. ESTERILIZACIÓN - vapor a presión, calor seco, óxido de etileno, rayos gamma B. DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES - hipoclorito de sodio, glutaraldheido, formaldheido, ácido peracético C. DESINFECCIÓN DE LA PIEL - clorhexidina, etanol al 70% D. PRODUCCIÓN DE VACUNAS - formaldheido, beta-propiolactona, psoraleno + UV