Lic. en Bioquímica Brock. Biología de los microorganismos ed. 2009

Transcripción

1 VIRUS Lic. en Bioquímica-2016 Brock. Biología de los microorganismos ed Objetivos Definir virus y diferenciarlos de las bacterias Clasificar los virus según estructura, hospedador, material genético Mencionar métodos para cultivar e identificar virus Definir ciclo de multiplicación de los virus Definir entidades subviricas, viroides y priones Analizar bacteriófagos característicos T4; Lamda

2 Propiedades generales de los virus: Virus: agente infeccioso que no puede replicarse independientemente de una célula hospedadora. No es una célula. Virión: - Forma extracelular de un virus - Facilita la transmisión de una célula hospedadora a otra Contiene ácido nucleico como genoma, rodeado por una cubierta proteica y en algunos casos, otras capas externas TAMAÑO DE LOS VIRUS Varía desde los 20 nm como Parvovirus (Parvovirus B19) y Picornavirus (Enterovirus, Rhinovirus, Hepatovirus, etc ) hasta los 300 nm como los Poxvirus; tamaño semejante a Chlamydias Parapoxvirus, Orthopoxvirus, Molluscipoxvirus). De 100 a veces más pequeños que las células que infectan. Sólo se visualizan al microscopio electrónico por lo que para identificarlas se suelen usar reacciones de infectividad biológica o serológica o incluso análisis específicos de enzimas. 1nm es igual a micrometro

3 Comparación de tamaños de virus y bacteria Fuente: Tortora. Introduccion a la microbiología Necesitan células para replicarse Cada virus ataca un determinado tipo de célula Ejemplo CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS Virus de la Hepatitis Virus de la Rabia Virus de Poliomielitis Virus de Paperas Hígado SNC SNC Glándulas Parótidas

4 CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS Tres grupos en función de la célula que infecten (hospedador) Virus vegetales Virus animales Bacteriófagos Rango de huésped: un virus afectará determinadas especies dentro de cada grupo. Taxonómicamente: se identifica orden, familia, género y especie Familia: se define por morfología, estructura del genoma, las estrategias de replicación Simetría de los virus Las nucleocápsides (ácido nucleico y las proteínas) están construídas de una manera altamente simétrica Simetría: se refiere a la manera en la que las unidades morfológicas proteicas se ordenan en la cubierta vírica. Existen dos tipos: Cilíndrica: helicoidal Esférica: icosaédrica Poseen 20 caras, 30 bordes y 12 vértices. Cada cara es un triángulo equilátero, resultando una estructura simétrica. Ej: adenovirus, papovavirus y herpesvirus.

5 Simetría viral icosaédrica helicoidal Simetría mixta Bacteriófagos

6 CLASIFICACION DE BALTIMORE Basada en la relación entre el genoma viral y su RNAm Cómo se replican los virus según su ácido nucleico? dsdna (±) virus Class I Class VII ssdna (+) virus Class II dsrna (±) virus Class III ssrna (+) virus Class IV ssrna ( ) virus Class V ssrna (+) retrovirus Class VI Synthesis of other strand dsdna intermediate Transcription of minus strand Used directly as mrna Transcription of minus strand Reverse transcription Transcription of minus strand mrna (+) mrna (+) Genome replication: Class I, classical semiconservative Class II, classical semiconservative, discard ( ) strand Class VII, transcription followed by reverse transcription DNA viruses Ejemplos: Transcription of minus strand dsdna intermediate Genome replication: Class III, make ssrna (+) and transcribe from this to give ssrna ( ) partner Class IV, make ssrna ( ) and transcribe from this to give ssrna (+) genome Class V, make ssrna (+) and transcribe from this to give ssrna ( ) genome Class VI, make ssrna (+) genome by transcription of ( ) strand of dsdna RNA viruses I: herpes VI: Retrovirus II: parvovirus VII: Hepatitis B III: IBDV (bursitis infecciosa-pollos) IV: TMV, hepatitis C V: sarampión, gripe, dengue 2012 Pearson Education, Inc. Retrovirus Transcriptasa reversa (viral) para Replicación, mediante RNA Transcriptasa reversa (viral) Proteasa, Integrasa - dentro del virus RNA polimerasa (hospedador) RNA polimerasa (hospedador) DNA polimerasa (hospedador) RNA polimerasa (hospedador) RNA polimerasa (hospedador) RNA polimerasa dependiente de RNA (viral) - dentro del virus RNA polimerasa dependiente de RNA (virus) RNA polimerasa dependiente de RNA (viral) - dentro del virus RNA polimerasa dependiente de RNA (virus) (Actúa como mrna) Polimerasas del hospedador sólo usan dsdna para formar mrna (ni ssdna ni RNA)

7 ENZIMAS DE LOS VIRIONES Sólo ácido nucleico y cápside? -Lisozima -RNA polimerasas -Transcriptasa reversa -Neuraminidasas -Hemaglutininas Crecimiento y cuantificación Para el estudio de virus bacterianos se usan cultivos puros en medios líquidos o semisólidos. Son los más fáciles de estudiar porque hay muchas bacterias fáciles de cultivar. Los más difíciles de cultivar son los virus vegetales porque a veces el estudio requiere de la planta entera; se deben producir orificios en la pared de la planta para permitir la penetración del virus Los virus animales afortunadamente pueden ser estudiados porque muchos virus animales pueden ser cultivados en tejidos o cultivos celulares, facilitando la investigación.

8 CÓMO CULTIVAR VIRUS? -Bacteriófagos Cuando ocurre una infección viral exitosa, las células se lisan, formando una placa. Contando el número de unidades de formación de placa, se puede calcular el título o el número de unidades infecciosas de virus. No siempre coincide la cuantificación por los métodos mencionados. Por qué?? Microscopio electrónico vs. Recuento de placas de lisis Eficiencia de la siembra El Nº de unidades formadoras de calvas es siempre menor que el Rto microscópico Ej. : - virus defectivos (alta tasa de mutación en virus ARN) - cápsides vacías - algunos no logran infectar con éxito (nunca es 100%)

9 Virus humanos y animales: CÓMO CULTIVAR VIRUS? -Huevos embrionados - cultivos primarios y líneas celulares Cultivo de tejidos Cultivos primarios: consisten en una variedad de tipos celulares y tienen un crecimiento limitado in vitro conservando en sus divisiones las características fisiológicas y genéticas del tejido de origen Líneas celulares: pueden seguir su multiplicación in vitro durante muchas divisiones. Pueden ser de origen neoplásico

10 Cultivos celulares Un cultivo celular se obtiene induciendo el crecimiento de un órgano del animal de experimentación. Se separan las células por instrumentación quirúrgica, disociación de las mismas por tratamiento enzimático para romper las uniones intercelulares. Se coloca en una superficie plana (caja de Petri, o botella de Roux) y se adiciona medio de cultivo líquido. Se forma una monocapa porque las células liberan material glicoproteico que permite su adhesión en el fondo El medio es complejo, tiene aminoácidos, vitaminas suero fetal bovino (SFB), sales, glucosa, buffer, indicador de ph, antibióticos, antifúngicos. Alteraciones inducidas en la célula huésped Efecto citopático: Destrucción de la monocapa Formación de células multinucleadas Desarrollo de cuerpos de inclusión Transformación Cuerpos de Negri característicos presentes en una célula de Purkinje del cerebelo de un paciente que falleció por rabia.

11 BACTERIOFAGOS Receptores de fagos en Escherichia coli: -LPS (lipopolisacárido) -pili sexual -proteína de captación de hierro -proteína transportadora de maltosa REPLICACIÓN VÍRICA -Unión o adsorción del virión a la célula hospedadora -Penetración, entrada o inyección del ácido nucleico en la célula -Ciclo lítico -Síntesis del ácido nucleico y las proteínas del virus -Ensamblaje de las cápsides y empaquetamiento de los genomas víricos en ellas -Liberación de los viriones maduros por lisis celular o por gemación. Ciclo lisogénico - Integración en el genoma del hospedador - Replicación de la bacteria y síntesis de nuevas proteínas (ej. toxinas)

12 CICLO LÍTICO Fago virulento CICLO LISOGÉNICO Fago temperado o profago Bacteria lisógena Célula permisiva Ciclo lítico Fijación Penetración Eclipse Ensamblaje Liberación El ciclo lítico de lambda puede ser inducido por agentes que dañan el ADN: luz UV, rayos X, sustancias químicas (mostaza nitrogenadas).

13 CÓMO LA BACTERIA EVADE LA INFECCIÓN POR UN VIRUS? -Ausencia de receptores en el hospedador -Endonucleasas de restricción, para cortar DNA de fagos -CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) son loci que contienen múltiples repeticiones cortas directas que funcionan como sistema inmune presente en bacterias y archae. Como RNAi, silenciarían la expresión de DNA extraño como plásmidos y fagos CÓMO SE DEFIENDE UN VIRUS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEL HOSPEDADOR? Modificando su propio DNA por: - glicosilación - metilación -acetilación - Codificando proteínas que inhiben los sistemas de restricción de la bacteria ENTIDADES SUBVÍRICAS - VIRUS AUXILIARES: virus parásitos de otros virus VIRUS DEFECTIVOS: dependen de virus intactos del mismo tipo para que les proporcionen las funciones necesarias (Ej: P4 depende de P2 porque no codifica proteínas de la cápside) VIRUS SATÉLITES: dependen de virus que no están emparentados. Se encuentran en animales y plantas (Ej: virus adenoasociado necesita de un Adenovirus) -VIROIDES -PRIONES

14 Son los patógenos más pequeños Viroides Son moléculas infecciosas de ARN monocatenario circular que carecen de cubierta proteica. Tienen estabilidad extracelular debido a la estructura que poseen, molécula corta de doble cadena con extremos cerrados Replican en núcleo de células vegetales Viajan de célula en célula vegetal a través de los plasmodesmos Producen enfermedades en plantas Impacto en agricultura No tiene receptores por eso ingresan por heridas en las plantas producidas por insectos o acción mecánica Prión (PrP SC ) (PrnP) Agente infeccioso: es una proteína patógena que tiene alterada su estructura terciaria, teniendo un incorrecto plegamiento. Sin ADN ni ARN, sólo aminoácidos.

15 PRIONES Prión: pequeña partícula infecciosa proteica. Provocan encefalopatías espongiformes (enfermedad neurodegenerativa). Proteínas modificadas del hospedador que puede transmitir la enfermedad. Humanos Kuru Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) Animales Scrapie Encefalopatía espongiforme bovina (vacas locas) COMPARACION VIRUS VS PRIONES Presencia Acido Nucleico Presencia de proteínas Desinfección con Formaldehído Proteasas Calor (80ºC) Radiaciones ionizantes y UV Patología Efecto citopatológico Periodo de incubación Respuesta inflamatoria Respuesta inmunitaria VIRUS Sí Sí Sí Algunos La mayoría Sí Sí Dep. virus Sí Sí PRION No? Sí No No No No No Largo No No

16 ESTRUCTURA Y FISIOLOGIA El prototipo de estos microorganismos es PrPSc (prión proteico del scrapie) Tanto humanos como algunos animales codifican una proteina PrPC (prión proteico celular) COMPARACION PrPSc VS PrPc Estructura Resistencia a la proteasa Presencia de Scrapie en fibrillas Localización dentro o sobre las células Multiplicación PrPSc Globular Sí Sí Vesículas Citoplasmática s Días PrPC Extendida No No Membranas Plasmáticas Horas PATOGENESIS Características patogénicas de los virus lentos La encefalopatía espongiforme describe: El aspecto de las neuronas vacuoladas La pérdida de función. Falta de antigenicidad /ausencia de reacción inmunitaria. Ausencia de inflamación. Síntomas: pérdida de control muscular, escalofríos, temblores, demencia.

17 PATOGENESIS PrPSc se une a la PrPc que hay en la superficie celular y hace que se transforme en PrPSc, se desprenda de la célula y se acumule en las placas mieloides del cerebro. Al ser proteinas del hospedador no se produce respuesta inmunitaria) A continuación la célula repone PrPc. Las neuronas y los fagocitos absorben la PrPSc, difícil de degradar, lo que contribuye a la vacuolización del tejido cerebral y destrucción tisular. Los priones se pueden aislar de distintos tejidos del cerebral pero solamente el cerebro presenta alguna lesión. Una proteína aberrante provoca la enfermedad: PrPc PrPSc

18 PrPSc se une a la PrPc que hay en la superficie celular PrPSc hace que PrPc se transforme en PrPSc y se desprenda de la célula.

19 A continuación la célula repone PrPc. Las neuronas y los fagocitos absorben la PrPSc, difícil de degradar, lo que contribuye a la vacuolización del tejido cerebral y destrucción tisular.

20 Neurona Nucleo Prnp DNA Traducción PrP c (prion normal) Transcription PrP Sc -induce mal plegamiento Función Normal Función Anormal PrP Sc (prion malformado) 2012 Pearson Education, Inc. La enfermedad por priones ocurre por 3 mecanismos posibles: Infecciosa: la forma patogénica de la proteína priónica se transmite entre animales o humanos Esporádica: mal plegamiento al azar de una proteína priónica normal en un individuo sano Por vía hereditaria: una mutación en el gen de la proteína PrP se traduce en una proteína que cambia para convertirse en patógena.

21 BACTERIÓFAGOS Referencia: Brock. Biología de los microorganismos. 12 ed Virus bacterianos

22 CARACTERÍSTICAS DEL FAGO T4 Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli -Es virulento: desencadena ciclos líticos -DNA: bicatenario -codifica algunos de sus trna -sufre permutación circular (genera moléculas de ADN de la longitud del genoma del virus con secuencias permutadas por una endonuclesa que corta longitudes constantes de ADN independientemente de la secuencia) forma concatémeros -Sintetiza proteínas que modifiquen la RNA pol del hospedador para reconocer los promotores medios del fago. Necesita el factor sigma del hospedador -Tiene la base 5-hidroximetilcitosina (en lugar de citosina) que se glicosila y permite resistir ataque por ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION del hospedador. Las enzimas para la síntesis de esta base la codifica el virus Características del Fago T4 Generación de moléculas de ADN de T4 con secuencias permutada por una endonucleasa que corta longitudes constantes de ADN sin tener en cuenta la secuencia. Izquierda: copias de T4 se recombinan para formar un concatemero. Medio: flechas rojas, sitios de cortes de la endonucleasa. Derecha: moléculas genoma generado. Cada uno de los genomas T4 formados de la derecha contiene los genes A-G, pero los terminales son únicos en cada molécula.

23 Genéticamente, el DNA de T4 se representa como un círculo, aún cuando el genoma es en sí lineal, debido al fenómeno denominado PERMUTACION CIRCULAR. Esto se debe a que para cada virus, la secuencia terminal del DNA puede variar, aunque las repeticiones del principio y final del genoma están presentes para cada virión. Explicación: Mecanismo de replicación. Desde un origen de replicación único, se forma un OJO de replicación, que acabará formando la horquilla típica de replicación bidireccional. Hay un extremo que queda temporalmente libre (en la forma Y) donde está la secuencia repetida. Esta secuencia puede asociarse con la cadena complementaria del extremo opuesto, formándose un CONCATEMERO, tras rellenarse los huecos con DNApol y DNA ligasa. El problema de T4, que no tienen otros virus T impares (T7, por ejemplo) es que estos concatémeros serán cortados por una enzima que no corta sitios específicos, sino que lo hace cuando la cabeza del virión está llena. Esto ocurre con algo más de un genoma, por lo que se originarán virus con extremos repetidos.:abcd...abcd Al cortarse el genoma (Abcd...Abcd) por una enzima que no es específica de nucleótido, se desplaza la secuencia, dando la sensación de una estructura genéticamente circular La circularidad puede explicarse por redundancia terminal, donde cada cromosoma comienza y acaba con la misma secuencia de nucleótidos y por permutación circular, en la que los extremos redundantes no son los mismos para cada cromosoma, sino que son aleatorios.

24 Fago T 4 Evolución temporal de la infección por T4

25 CARACTERÍSTICAS DEL FAGO LAMBDA -Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli DNA: - se integra al genoma bacteriano (fago lambda) o puede existir como plásmido (fago P1) -Predomina la expresión de un represor de lisis (ci) -Por eso se llama FAGO ATEMPERADO o PROFAGO: desencadena ciclos lisogénicos en las células infectadas. -Las bacterias infectadas presentan nuevas propiedades, por ej. expresan toxinas que las convierte en patógenas. CARACTERÍSTICAS DEL FAGO LAMBDA -Las bacterias infectadas por fago lambda son inmunes al ataque por partículas similares -Puede revertir a fago virulento: la inactivación del represor de lisis (ci) induce el CICLO LÍTICO debido al aumento de la expresión de la proteína Cro. -El DNA es lineal bicatenario con extremos 5 cohesivos formados por 12 nucleótidos complementarios: sitio cos. Al entrar al hospedador se aparean y el DNA pasa a ser circular. -Se integra al cromosoma de Escherichia coli por el sitio att

26 LISOGENIA Integración de ADN de lambda en el hospedador cos cos Enzima: integrasa Operón gal: utilización galactosa Operón bio: síntesis biotina Operón moa: síntesis cofactores molibdeno Bacteria hospedadora expresa nuevas propiedades Ejemplos? Toxinas Replicación de lambda por el círculo rodante La hebra verde oscuro desenrolla, se está replicando en su extremo opuesto. Es una síntesis asimétrico porque una de las cadenas parentales sigue sirviendo como molde y el otro se utiliza sólo una vez

27 GENOMA DE LAMBDA CICLO LÍTICO O LISOGÉNICO? Cro versus ci Para establecer lisogenia, dos eventos deben suceder: -Evitar la producción de proteínas tardías - Una copia del genoma lambda debe integrarse en el cromosoma del huésped. Elementos claves: dos proteínas represoras el represor de lambda ci y el represor Cro ci > Cro => LISOGENIA ci < Cro => LISIS FAGO LAMBDA: CICLO LISOGÉNICO o LÍTICO? Ciclo lisogénico: -Síntesis activa de ci (represor de ciclo lítico) -Genoma de fago lambda está integrado en el DNA del hospedador -No hay producción de proteínas tardías Ciclo lítico: -Síntesis de grandes cantidades de Cro -Cro reprime proteínas cii y ciii que inducen síntesis de ci -Proteasa FtsH del hospedador degrada cii. Esto afecta a ci.

28 Fago MS2 - Bacteriófago ARN - Codifica 4 proteínas (Maduración, cápside, proteína de lisis, replicasa - SOLAPAMIENTO DE GENES -HOSPEDADOR: E. coli F +, tiene pili sexuales donde el fago se une. El ARN viral actúa como RNAm y la regulación de su expresión génica se basa en el control del acceso del ribosoma a los diferentes inicios de traducción del virus Pared de la bacteria GEMACIÓN Fagos M13, fd, f1 -Fagos de ADN filamentosos con simetría helicoidal -Infectan células capaces de actuar como donadoras en una conjugación - Genoma es ADN circular de cadena sencilla -No produce lisis de la bacteria, se libera por GEMACION por lo que la célula tiene un retraso en el crecimiento pero puede coexistir con el virus M13 se usa como vector de clonación en Ingeniería Genética.

29 Bacteriófago Mu (mutador) - Es un fago atemperado - Se replica POR TRANSPOSICIÓN - Acetilación de residuos de adenina para eludir los sistemas de restricción del hospedador Elementos transponibles son secuencias de ADN que se mueven de un punto a otro en el genoma del hospedador -FAGO ATEMPERADO: Se integra dentro de genes del hospedador e induce MUTACIONES en el genoma del hospedador -Puede revertir A CICLO LÍTICO - Se usa en Ingeniería Genética para generar fenotipos bacterianos mutantes. Mu y la región invertible G: determina especificidad de hospedador Especificidad de hospedador según fibras de cola: G + (lee SU): E. coli K12; G - (lee S U ): otros hospedadores

30 METODOS COMUNES PARA INACTIVAR VIRUS A.ESTERILIZACIÓN - vapor a presión, calor seco, óxido de etileno, rayos gamma B. DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES - hipoclorito de sodio, glutaraldheído, formaldheído, ácido peracético C. DESINFECCIÓN DE LA PIEL - clorhexidina, etanol al 70% ACCIÓN DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE VIRUS Agentes Físicos 1.Temperatura; los virus son muy termolábiles 55-60ºC viven unos segundos 37ºC unos minutos 20ºC unas horas 4ºC unos días -70ºC pueden vivir de meses o años. Los V envueltos son más sensibles que desnudos. La congelación/descongelación provocan pérdida de infectividad (se deben congelar las muestras si no se procesan inmediatamente)

31 ACCIÓN DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE VIRUS Agentes Físicos 2.- Radiaciones: Alteran los ácidos nucleicos. Los daños pueden ser por: distorsión estructural, mutaciones puntuales, ruptura de la cadena de DNA Los virus monocatenarios son más sensibles que los de doble cadena Sales: se estabilizan mediante la adición de sales como MgCl 2, MgSO 4 y Na 2 SO 4. ph: los virus son estables entre ph 5 y 9. Reacción a los agentes químicos Éter: virus envueltos son los más afectados. Formol: suprime la infectividad de virus al reaccionar con su ácido nucleico. Se emplea en la producción de vacunas a base de virus inactivados. Antibióticos y otros antibacterianos: no tienen efecto sobre los virus. Amonio cuaternario y compuestos a base de yodo: no los afecta. Hipoclorito de sodio: efectivo en concentraciones mayores que las requeridas para destruir bacterias.

32 Muchas Gracias!!