Bacteriofago Lambda (λ)

Transcripción

1 Bacteriofago Lambda (λ) Capítulo 8 Molecular Genetics of Bacteria. 3ed. L. Snyder & W. Champness ASM Press. Washington, D.C. 19/09/2016 Lautaro Diacovich Bacteriófagos - Ciclo Vital. Virulentos Crecen de manera Lítica lisis de Hospedador (T4, T7). Atemperados Capaces de formar LISÓGENOS Integran su ADN al cromosoma bacteriano (λ, P1) Existen de manera latente o quiescente como PROFAGO Estímulo Inducción crecimiento LÍTICO

2 Organización génica del Fago λ - Genoma: dsdna lineal ( pb) 46 genes - Extremos cohesivos 5 protruding (12 b, ssdna) cos - Infección se circulariza - DNA ligasa del húesped DNA circular unido covalentemente - Genes agrupados según su función (Clusters) - Proteínas que actúan sobre el DNA, en regiones cercana a su gen Vía lítica y lisogénica del Fago λ

3 Mapa genético del Fago λ Mapa genético del Fago λ circularizado luego de la unión de los sitios cos

4 Ciclo lítico del Fago λ Tiempo del ciclo de vida (en min a 37ºC) t = 0 Adsorción del Fago, inyección del ADN t = 3 1er Síntesis del ARNm (pre-early) t = 5 Se sintetizan 2 clases de ARNm tempranos t = 6 Comienza la replicación del ADN t = 9 Comienza la síntesis de ARNm tardíos t = 10 Comienza la producción de proteínas estructurales t = 22 Se completa la 1er partícula fágica t = 45 Lisis y salida de la progenie fágica Productos génicos y sitios codificados por el ADN de λ

5 Regulación de la transcripción por anti-terminación (Proteína N). ADN λ entra a la célula Transcripción normal 2 ARNm cortos Sitios de terminación. Proteína Cro Inhibidor de la síntesis de un represor. Proteína N Factor de anti-terminación Permite que la ARNpol continúe a lo largo del ADN. Sitios nut Necesarios para la acción de N. Mutaciones en los sitios nut Previenen la expresión de los genes siguientes (cis acting) a los terminadores D. La unión de N con nut es con el ARNm y no con el ADN nutr nutr. Proteínas del hospedador (Nus) asisten la unión. (mutaciones en E. coli que previene la muerte por λ) - Nus A G también intervienen en mecanismos de anti-terminación en el hospedador no infectado nutr Esquema de la interacción RNApol Proteína N Proteínas Nus - RNAm

6 Regulación por anti-terminación Sitios nut Hairpin Box B importante para la unión de N con el RNAm Consecuencias. Complejo de Anti-terminación Transcribe sobre t R 1 genes O y P Replicación. Producto del gen Q Transcripción de genes tardíos. nutl transcripción de genes gam y red Recombinación Regulación por anti-terminación (Proteína Q) Cascada de Regulatoria Anti-term N gen Q Anti-term Q Transcripción de genes tardíos (cabeza, cola). ARNpol Transcribe una ARN corto (16-17 nt) a partir de promotor p R y para (sitio de pausa). Sitio de pausa región -10 ~ al promotor. Protína Q se carga sobre la ARNpol en pausa permite que la ARNpol continúe. Transcripción de genes tardíos Particularidades: - Secuencia cercana a promotor, sitio qut - Proteína Q se une al ADN (no en el ARNm) - ARNpol en el sitio de pausa Otros ejemplos de regulación por anti-terminación. P22. Genes Bacterianos (operon bgl E. coli genes de aminoacil-arnt sintetasa B.subtilis). Secuencias similares nut. Regulación de genes eucariotas (oncogen myc en mamíferos). Virus del SIDA

7 Desarrollo Lítico del Fago λ Organización génica del Fago λ Q 3 ETAPAS Expresión de genes N y cro Expresión de genes con roles en Replicación y Recombinación Expresión de genes tardíos: - Proteínas cabeza y cola de la partícula fágica - Enzimas de lisis celular Replicación del ADN de λ ADN λ lineal Circular (extremos cohesivos o sitios cos) sticky ADN ligasa unión covalente. O y P ADN priming (ori). O torsión del ADN (~ DnaA). O P DnaB (helicasa). P Pirate (~ DnaC). Síntesis de ARN (p R ) Separación de hebras Primer Replicación a la derecha Corte en sitios cos Sistema Ter EMPAQUETAMIENTO. Horquilla de Replicación en ambas direcciones Hebra Lider Hebra Retrasada. Gam

8 Fago λ como herramienta de clonado Vectores de clonado derivados del fago λ. Multiplicidad de λy alto número de copias. Síntesis de grandes cantidades de ADN y Proteínas. Proteínas tóxicas (no sintetizada hasta que el fago no infecta la célula). Bibliotecas de fagos fáciles de almacenar (cabeza estable de λ) Cósmidos. Empaquetamiento del ADN de λ reconocimiento de sitios cos. Cualquier ADN ~ 50 Kb con 2 sitios cos puede ser empaquetado en la cabeza de λ. Plásmidos con sitios cos (ventaja para uso en ingeniería genética). Empaquetamiento in vitro en tubo (plásmidos - extractos de cél. infectadas con λ - cabeza-cola). Utilizadas para introducir cósmidos en células por infección ( eficiencia). Tamaño limitado del ADN (fragmento de similar tamaño Librerías de ADN) Lisogenia. Estado lisogénico de λ muy pocos genes se expresan. Evidencia Las células conteniendo el profago son inmunes a la super-infección por λ. Placas de λ características. λ mutantes (ci, cii, ciii) Previenen la formación del lisógeno (placas claras)

9 Placas de Lisis (placas claras) Lisogenia Producto del gen cii. Competencia entre CII y los productos de los genes líticos (1% Lisogenia). Factores ambientales y riqueza del medio. CIII Inhibe la degradación de CII por una proteasa celular (rol indirecto) ACTIVADOR REPRESOR

10 Integración del fago λ. Int Recombinasa sitio-específia (Y recombinase family Tyr). Integración en región no esencial del cromosoma de E. coli (no hay fenotipo). Otros fagos se integran en genes esenciales (adaptaciones). Sitio attp (interno) Mapa del profago diferente al λ empaquetado. Recombinación sitio-específica att no similares (modelo Campbell) secuencia O (15 pb) GCTT T(TTTATAC)TAA Mantenimiento de la Lisogenia. Lisogenia establecida el gen del represor ci es un de los pocos transcriptos. CI se une a 2 regiones operadores (or y ol pr y pl). Previene la transcripción de la mayoría de los genes de λ. En estado profágico se transcribe el gen represor ci a partir del p RM y no de p RE CI Transcripción de genes líticos. Niveles óptimos de CI CI Dificultad para inducir el profago Desperdicio energético por síntesis de CI. Mecanismo de regulación de síntesis del represor en Lisogenia Modelo de otros sistemas. Represor CI 2 dominios (dimerización unión) Modelo: Proteína con dominios separables C-terminal: Promueve la formación de dímeros y tetrámeros N-terminal: Se une a la secuencia operadora del ADN. CI puede actuar como ACTIVADOR según la circunstancia

11 Mantenimiento de la Lisogenia Regulación de la Síntesis del Represor CI CI previene la transcripción de genes O y P CI Regula su propia transcripción ACTIVADOR Débil unión de CI con O R 3 y O L 3 TORSIÓN del ADN Represión de la transcripción de los genes de λ REPRESOR Estabilización por Tetramerización Regulación Robusta Unión Cooperativa CI

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13 Crystal structure of the lambda repressor and a model for pairwise cooperative operator binding. Stayrook, S.E., Jaru-Ampornpan, P., Ni, J., Hochschild, A., Lewis, M. Journal: (2008) Nature 452: N-Terminal CI DNA

14 Inmunidad a la Superinfección Durante la lisogenia:. Represor CI Previene la transcripción de genes de λ por unión a los sitios operadores Previene la re-infección por otro fago por unión a sus sitios operadores. Bacteria Lisogénica Inmune a la superinfección con λ Puede ser infectada con otros fagos con sitios operadores diferentes (CI no puede unirse) FAGOS. Heteroinmunes Secuencias operadoras diferentes. Homoinmunes Secuencias operadoras iguales (Independientemente de la similitud o diferencia en el resto de los genes) Inducción del fago λ. Profago ADN de la célula hospedadora sufre un daño severo por irradiación o químicos Inducción del profago Ciclo Lítico Proceso de Reparación Auto-

15 Inducción del fago λ - Proteína Cro. Temprano durante la Inducción Continua la síntesis del Represor CI: Interfiere con el desarrollo lítico Podría provocar el reestablecimiento de la lisogenia. Cro previene la síntesis de CI - Previene la represión por CI - Activa su propia síntesis - Previene la unión de CI - = Operadores O L - p L no reprimido Síntesis de Int y Xis Affinity of o R for Cro: o R3 > o R2 = o R 1 Unión de la proteína Cro a la región operadora del ADN

16 Inducción del fago λ Escisión. Represor sin acción Transcripción a partir de p L y p R Escisión del ADN λ del cromosoma. Recombinación sitio específica Sitios híbridos attp-attb Int y Xis (luego de la Inducción) - Transcripción conjunta - Xis no es necesaria - Provocaría la escisión luego de la integración Exonucleasa 3-5 Regulación postranscripcional Activación por CII No hay secuencia nutl No se une N Retro-regulación Regulación por secuencias downstream (mutaciones estabilizan el ARNm). Int/Xis Escisión ADN. O y P se transcriben (p R ). Replicación de λ ADN. ADN dañado (min) Ciclo lítico. Nivel CI. Lisis celular 100 fagos (1h) (medio y temp) Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico No hay CI Competencia entre el activador CII y Cro (MOI Estado metabólico de la célula Medio de crecimiento temp) (0,1%) Medio rico Proteasas Se degrada CII Medio pobre Proteasas No se degrada CII DNA dilutes out the CI repressor ARN antisentido activado por CII

17 Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico Table 8.3 Steps leading to lytic growth and lysogeny Steps leading to lytic growth 1. Transcription from p L and p R 2. N and Cro are made 3. N allows CII expression 4. CII degraded 5. Low CII concentration means that little CI is made 6. Cro binds at O R3 and O L3, blocking binding by any low level of CI that is made 7. Meanwhile, N allows O and P replication gen transcription 8. A second antiterminator, Q, allows late-gene transcription, and so λ phage particles are made Steps leading to lysogeny 1. Same as for lytic growth 2. Same as for lytic growth 3. Same as for lytic growth 4. CII stable 5a. High CII concentration activates p I, and so Int is made and λ DNA integrates 5b. High CII concentration activates p RE, and so CI is made 6. CI outcompetes Cro, and so CI binding at O R3 and O L3 both represses p L and p R and positively autoregulates at prm, mantaining lysogeny Transducción Especializada. Transducción generalizada el fago porta y puede transducir DNA de la células hospedadora (cualquier región y solo ADN de la célula). Transducción especializada el fago porta solo genes cercanos a la región de attachment (transporta tanto genes de la célula como fágicos)

18 Transducción Especializada Di-lisógeno Otros fagos que forman lisógenos (P2, P4, Mu)

19 Utilización de la forma lisogénica de fagos como vectores de clonado. Fagos atemperados pueden multiplicarse como fagos grandes cantidades de ADN. Se integra al cromosoma Estudios de complementación (2 copias del mismo gen). Facilita el mapeo genético y reemplazo de genes: - Fago sin sitio att con un fácil marcador de selección (ATB R ) - Mapeo genético genes sin fenotipo - Gen de interés clonado en el ADN del fago - Se introduce por empaquetamiento in vitro en infección o transfección - Recombinación Conversión Lisogénica y Patogénesis Bacteriana Como los fagos pueden contribuir a la patogenicidad de bacterias. Profagos pueden portar factores de virulencia o toxinas Patogenia de la bacteria lisogénica. Morons (more DNA): Se pueden expresar a partir de su propio promotor aunque otros genes del fago estén reprimidos Ejemplos. E. coli y Disentería: Toxina Shiga (diarrea hemorrágica) φ361 E. coli O157:H7. Corynebacterium diphtheriae (difteria) Lisógeno de fago β gen tox Enz. mata cel. euc.. Vibrio cholerae (cólera) CTXφ fago filamentoso ssadn genes ctxa y ctxb. Clostridium botulismo y tétanos

20 Genética de la Lisogenia de λ Experimentos Genéticos con fago λ. Aislamiento de mutantes involucradas en la lisogenia Placas claras (mutantes de tipo C). Infección con 2 fagos mutantes Test de Complementación (ambos forman placas claras) Monitoreo de formación de lisógeno Inmunidad a la infección. Identificación de mutantes: ci, cii, ciii, Int (trans), vir (o R y o L ) (cis) - CII y CIII necesarias para generar el lisógeno, pero no para mantenerlo - CI estrictamente requerido para generar y mantener el lisógeno Genética del represor CI. Proteína Modular. Complementación intragénica. Célula lisogénica con fago con una mutación termosensible en ci Infectado con fagos con diferentes mutaciones termosensible en ci. TEMP. NO PERMISIVA Lisis Represor CI inactivado Lisógeno mutaciones complementarias (sólo unas pocas bacterias). Mutaciones C-terminal Unión al ADN N-terminal Formación de dímero

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22 Experimentos Genéticos con fago λ Genética del represor CI

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