Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniae. Conclusión: Las células R absorbieron algo de las células S principio transformante

Transcripción

1 TRANSFORMACIÓN

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3 Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniae Conclusión: Las células R absorbieron algo de las células S principio transformante

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5 El Principio transformante es DNA El Principio transformante

6 TRANSFORMACIÓN CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO Puede ser NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

7 TRANSFORMACIÓN Para qué tomar DNA exógeno?... Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación Algunas hipótesis que no son excluyentes.. I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

8 SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?

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10 TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más estudiadas son GRAM + Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis GRAM - Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente ETAPA 2: Procesamiento del DNA Unión Importe Recombinación

11 Etapa 1: Desarrollo de un estado competente Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Mitomicina C Alta densidad celular Temperatura, ph La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: nucleótidos/segundo a 30 C

12 La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

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14 TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL El caballito de batalla es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generación de organismos transgénicos

15 TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

16 PLÁSMIDOS

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18 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

19 En la transformación artificial cómo se induce el estado competente de una bacteria? 1. Tratamiento químico 2. Electroporación

20 E. coli Preparar células competentes de E. coli A= a 600 nm 3 ml medio Luria Incubar toda la noche a 37 C

21 Preparar células competentes de E. coli 3 ml NaCl 5 ml CaCl r.p.m. 5 min 4 C Resuspender Resuspender CÉLULAS COMPETENTES Incubar 20 min 2500 r.p.m 7 min

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23 LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO Plásmido 1 hr 42 C 70 s Inmediatamente en hielo Incubar a 37 C con agitación por 45 min 1 ml medio SOC

24 Esquema general

25 A nivel molecular

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27 Electroporación

28 Utilizaremos el plásmido pet-tem Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Sitio múltiple de restricción Origen de replicación

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30 Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos: La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos. La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino. ENZIMA INACTIVADORA Gentamicina adeniltransferasa Gentamicina acetiltransferasa Kanamicina acetiltransferasa Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO: Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina. Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

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32 Células no transformantes Células transformantes Medio Luiria + KANAMICINA

33 ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio